[发明专利]一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法

权利要求书

1.一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其包括如下步骤：

(1)溶液配制：包括样品溶液的配制、阳性对照品溶液配制、阴性对照溶液的配制、荧光生成反应液的配制；

(2)微阵列芯片的制备：将对照品溶液和样品溶液点于薄层预制硅胶板上；

(3)荧光猝灭图像的获取：用荧光生成反应液雾化微阵列芯片，置于薄层图像观察仪中，曝光，采集图像；

(4)数据处理：采集的图像导入TLC分析软件中进行像素分析，筛选出抗氧活性；

(5)用HPLC-DAD-CL/MS分析追踪抗氧活性成分的方法；

步骤(1)所述样品溶液的制备，取药材粉末，加入10～30倍量的30～95％乙醇，超声或回流提取15～60min，即得样品溶液；所述阳性对照品溶液：取Vitamin C对照品，加入30～95％乙醇定容成终浓度为10～30mg/mL溶液即可；所述阴性对照品溶液：取非还原性低聚糖类加水溶解成终浓度为10～30mg/mL溶液即可；所述荧光生成反应液包括荧光底物溶液、荧光激发液，所述荧光底物溶液是由鲁米诺用氢氧化钠溶液溶解成终浓度为(1.5～3)×10^-2M的混合溶液，所述荧光激发液是由铁氰化钾溶液和双氧水溶液配制成(1～2.5)×10^-1M的混合溶液：所述氢氧化钠浓度为(5～10)×10^-1M；所述铁氰化钾溶液浓度为(1～2)×10^-1M；所述双氧水浓度为20～40％；

步骤(2)中所述微阵列芯片的制备：将薄层预制硅胶板，对照品溶液和样品溶液以10×10矩阵方式点样于小板上，斑点中心距离3.5mm，用冷空气吹干板面残留溶剂，制备好的芯片置于真空干燥器内存放；

步骤(3)所述图像捕获：首先以双氧水铁氰化钾荧光激发液雾化，锯齿式均匀地雾化两个“之”字形，横向纵向各一个，然后以鲁米诺荧光底物液进行雾化，五个“之”字，迅速置于薄层图像观察仪中，曝光时间8000～12,000ms，增益1.0，进行图像采集；

步骤(4)数据处理：将步骤(3)采集的图像导入TLC Image Analyzer 5.0进行像素分析，选取强度高和噪音低的蓝色通道进行峰面积积分，线性回归、精密度考察、热图分析均由RGui 64-bit,version 3.2.3,Win 8 64-bit system处理生成，筛选出抗氧活性；

步骤(5)HPLC-DAD-CL/MS分析追踪活性成分的方法包括对筛选出抗氧化活性成分用高效液相色谱联合流动注射化学发光法HPLC-DAD-CL测定抗氧剂和质谱MS分析及评价，化学发光抗氧化图谱中较强峰对应的高效液相色谱峰具有较强抗氧活性，具有较强抗氧化活性的色谱峰信息由质谱进一步确认，所述高效液相色谱条件、超微弱化学发光检测条件、质谱条件根据药材成分进行设定。

2.如权利要求1所述的一种基于荧光猝灭原理对药材中抗氧剂的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(5)所述的HPLC-DAD-CL/MS分析追踪活性成分的方法，化学发光抗氧化图谱中较强峰对应的高效液相色谱峰具有较强抗氧活性，具有较强抗氧化活性的色谱峰信息由质谱进一步确认，包括如下步骤：

步骤A，高效液相色谱联合流动注射化学发光法HPLC-DAD-CL测定抗氧剂，超微弱化学发光检测器串联于高效液相色谱仪的DAD检测器；

高效液相色谱条件中色谱柱、流动相、流速、进样量、柱温、检测波长根据步骤(1)被测样品溶液活性成分设定；

超微弱化学发光检测器条件：流通池体积：50～500μL；高压：200～1200V；增益：1～16；

质谱MS分析条件：模式：负离子；扫描范围：100～1600m/z；喷雾电压：-1.0～-4.2kV；雾化器压力：20～50psi；脱溶剂气体温度：100～500℃，流速：3～9L/min；碰撞电压设置：50～120；碰撞能量：10～80；载气：高纯氮气。