[发明专利]基于复合编码探针杂交的DNA检测方法及复合编码探针

说明书

本发明公开了基于复合编码探针杂交的DNA检测方法及复合编码探针，所述复合编码探针为由第一子探针和第二子探针部分配对所形成的一双发卡结构的核酸序列，其包含：loop环状区、茎末端区和修饰基团区；所述第一子探针和第二子探针上位于茎末端区的碱基序列相互配对，所述第一子探针和第二子探针上位于loop环状区的碱基序列分别与待测靶标基因的正义链和反义链的不同区域的碱基序列构成互补序列；所述修饰基团区的数量为二，该修饰基团区包括相配合的荧光基团和淬灭基团。本发明提供的检测方法具有快速简单、成本低、非仪器依赖性、多重检测能力等特点，可多重实时检测的靶点数目明显多于目前仪器可检测的荧光通道数目。

技术领域

本发明涉及DNA检测领域，尤其涉及一种基于复合编码探针杂交的DNA检测方法及复合编码探针。

背景技术

实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR，FQ-PCR)技术最突出的优势是实现DNA扩增和检测的同步进行。该技术具有操作简便、快速高效、高敏感性等特点，已广泛用于分子诊断、分子生物学研究、动植物检疫以及食品安全检测等诸多研究领域，是快速检测的现代方法之一。

FQ-PCR扩增产物的富集过程既可通过非特异性荧光染料法来标示，也可以采用特异性荧光共振能量转移(FRET)探针技术来实现检测。非特异性荧光染料法尽管成本较低，但无法克服由于PCR非特异性扩增产物干扰造成的假阳性问题，并且由于荧光染料发光波长单一的局限，故而无法实现多重基因靶点的检测，在实际应用中受到了很大限制。

FRET探针本质为一寡核苷酸，其两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团后，在特异性扩增产物产生过程中，由于报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而使得荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，解决了非特异性扩增带来的假阳性问题。目前至少有5种荧光基团供FRET探针修饰标记，因此借助FRET探针技术实现了FQ-PCR在多重基因靶点依赖的基因分型应用。

目前来看，市场上应用FRET探针的技术主要包括：美国PE公司研制的水解探针(商品名：TaqMan，美国专利No.6,485,203)，Epoch公司在水解探针的基础上增加结合效率的MGB探针(美国专利No.7,205,105)，以及，分子信标探针(美国专利No.5,225,517)。

水解探针具有灵敏度高、重现性好等特点，但是由于本身检测区域的限制，原则上无法对特定靶点进行专一性识别。而分子信标探针基于其独特的空间结构，具有高度的靶点检测特异性，但其在PCR过程中存在退火不完全进而导致其检测灵敏性有限。同时，FRET探针技术也受到现有PCR检测仪器检测荧光通道的数量限制，目前的PCR检测仪器能同时检测5种荧光基团，理论上最多能够同时检测5种靶序列。因此，亟待人们通过技术创新去解决FQ-PCR检测容量低的问题。

中国发明专利申请(No.CN106121214A)：一种多色荧光熔解曲线的PCR检测方法，该专利公开了一种单色或双色多重FQ-PCR技术，其本质为一种PCR终点多靶点分析的检测方式。该类技术在无法实现扩增和检测的同步的同时，也受到“假阳性”熔解峰的干扰，其最高检测靶序列数还受到分析温度范围的限制。靶序列富集多重PCR技术(TEM-PCR)，借助巢式PCR再通过流式荧光技术(xMAP)将核酸芯片技术和流式荧光检测技术有效地结合在一起，很大程度解决了多重基因靶点依赖的基因分型应用难点。但该技术具有对特定仪器的依赖性、检测流程繁琐、易造成扩增产物污染等诸多缺点。中国发明专利申请(No.CN1936019A)：用于多重实时核酸扩增检测的探针编码方法，该专利公开的方案克服了上述技术的缺点，但其探针合成修饰存在技术不稳定性，检测成本也相应增高。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的DNA检测技术中检测容量小的不足，并提供一种快速简单、成本低、非仪器依赖性、多重检测能力更强的DNA检测方法，即通过提供一种复合编码探针从而实现该检测方法可多重实时检测的靶点数目明显多于目前仪器可检测的荧光通道数目。