[发明专利]一种预防4型禽腺病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种预防4型禽腺病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于兽用生物制品领域。本发明克隆、扩增FAdV 4C Hexon基因的C‑端和N‑端结构域基因；利用昆虫细胞‑杆状病毒双向表达系统构建能够共表达两种抗原蛋白的重组杆状病毒rBac‑HEXON‑P10‑C‑PH‑N，该重组病毒在昆虫细胞HF中高效表达FAdV 4C Hexon‑C与Hexon‑N抗原蛋白；经过提取纯化、BEI灭活后加入佐剂乳化制成疫苗。所述制备方法简单，能同时大量制备FAdV 4C Hexon‑C与Hexon‑N两种蛋白，耗时短，表达量高，大大节约了生产成本，适合大规模生产。所得重组亚单位疫苗，免疫效果良好，免疫剂量小并能有效预防禽腺病毒的感染。

技术领域

本发明涉及一种预防4型禽腺病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于兽用生物制品领域。

背景技术

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)可分为3个群，Ⅰ群比较著名的病毒株包括鸡胚致死孤儿病毒、鹌鹑支气管炎病毒和鸡包涵体肝炎病毒，Ⅱ群禽腺病毒包括火鸡出血性肠炎病毒、大理石脾病毒和鸡大脾病毒，Ⅲ群禽腺病毒只包括减蛋综合征病毒。Ⅰ群腺病毒可分为12个血清型，从高发病地区血清分析看，主要为C(血清4型)和E(血清8型)，安卡拉病(心包积水-肝炎综合征)就是由血清4型引起的，该病多发于肉鸡，近期也开始感染麻鸡以及产蛋鸡的育成鸡，并且育成鸡发病死亡率非常高。

I群禽腺病毒对外界环境具有很强的抵抗力，不仅能通过种蛋垂直传播给子代，还能通过污染的粪便、水槽以及种蛋进行水平传播，这就在临床上增加了其防控难度。虽然国内外有相关疫苗研制的很多报道，如灭活疫苗、减毒活疫苗及新兴起的基因工程疫苗，均能提供不同程度的免疫保护，但是目前仍然没有达到非常理想的治疗效果，而不同的血清型之间的同源性的差异，更增加了疫苗研制的难度。然而疫苗接种仍然是预防、控制甚至消灭禽腺病毒的主要措施之一。

目前对禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白(Hexon)的功能已进行了很多研究，该蛋白带有主要的属和亚属特异性抗原决定簇和次要的种特异性抗原决定簇，能引起极强的中和反应，当其被替代或突变将会导致中和免疫的缺失。该蛋白拥有两个主要功能区，保守基部区P1和P2，以及可变结构环L1-L4。Hexon蛋白前段氨基酸(N端)为可变结构环L1和基部区P1，其中几个比较大的抗原表位区都位于前段和中段，但疏水性氨基酸残基较多且暴露性差，它们整体分布在病毒颗粒的表面，是病毒引起宿主免疫应答的重要保护性抗原决定簇，是Hexon的结构域。

重组亚单位疫苗不含有核酸物质，安全性较好，接种后不会产生持续感染或潜伏感染，产生的免疫应答可以与野毒感染相区分，有利于疫病的控制和消灭。因此，研制一种生产成本低、生产效率高以及疫苗免疫效果好的禽腺病毒重组亚单位疫苗的生产方法具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种包含FAdV 4C Hexon蛋白的C-端和N-端两种抗原蛋白的重组亚单位疫苗。所提供的疫苗具有高效、安全性好、抗体整齐度高、保护率高的优点，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种抗原蛋白，包括Ⅰ群4型禽腺病毒FAdV 4C Hexon蛋白的C-端和N-端的结构域。

所述C-端的结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述N-端的结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供制备所述C-端和N-端的结构域的方法，包括下述步骤：

(1)扩增编码C端、N端结构域的基因：在C-端引物两端分别添加Xho I和Sph I酶切位点，而N-端引物两端分别添加BamH I和HindⅢ酶切位点，分别可扩增出C-端结构域序列(SEQ ID NO.2)，以及N-端结构域序列(SEQ ID NO.4)；