[发明专利]一种预防4型禽腺病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种抗原蛋白，其特征在于，由Ⅰ群4型禽腺病毒FAdV 4C Hexon蛋白的C-端和N-端的结构域组成；所述C-端的结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述N-端的结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.编码权利要求1所述抗原蛋白的基因。

3.制备权利要求1所述抗原蛋白的方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)扩增编码C端、N端结构域的基因：在C-端引物两端分别添加Xho I和Sph I酶切位点，而N-端引物两端分别添加BamH I和Hind Ⅲ酶切位点，分别可扩增出C-端结构域序列，以及N-端结构域序列；

(2)构建中转质粒：将pFastBac Dual和C-端结构域基因片段用Xho I和Sph I酶切后分别回收、纯化，连接过夜；将连接产物在无菌条件下转化T1感受态细胞中，筛选得到重组质粒，命名为pFastBac Dual-HEXON-P10-C；

(3)目的基因与重组中转质粒连接：将上述构建完成的pFastBac Dual-HEXON-P10-C和Hexon基因的N-端结构域基因片段用BamH I和Hind Ⅲ酶切后分别回收、纯化，连接过夜；

(4)连接产物转化感受态细胞：将连接产物在无菌条件下转化T1感受态细胞中，筛选得到重组质粒，命名为pFastBac Dual-HEXON-P10-C-PH-N；

(5)构建重组杆状病毒：将质粒pFastBac Dual-HEXON-P10-C-PH-N转入大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中，筛选得到重组杆粒，命名为rBacmid-HEXON-P10-C-PH-N；

(6)重组杆粒转染sf9细胞：将提纯的重组杆粒用脂质体转染的方法将重组杆粒转染sf9细胞，获得F1代重组杆状病毒rBac-HEXON-P10-C-PH-N；

(7)重组Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白的大量表达：将鉴定正确的重组病毒以MOI＝1～10的接毒量接种HF细胞大量培养，离心收集培养液上清，即获得含有大量的重组Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述重组Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白的进一步纯化方法：利用镍柱HisTrap HP，5mL对重组蛋白进行纯化，并对纯化后的重组蛋白进行透析处理，去除纯化样品中的咪唑和氯化钠。

5.一种用于预防Ⅰ群4型禽腺病毒的重组亚单位疫苗，其特征在于，包括权利要求1所述抗原蛋白和疫苗佐剂。

6.根据权利要求5所述的用于预防Ⅰ群4型禽腺病毒的重组亚单位疫苗，其特征在于，所述Hexon蛋白的C-端和N-端结构域蛋白经过BEI灭活。

7.根据权利要求5或6所述的一种用于预防Ⅰ群4型禽腺病毒的重组亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗中抗原区蛋白的含量在75～100μg/mL之间。

8.根据权利要求5或6所述的一种用于预防Ⅰ群4型禽腺病毒的重组亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗中的佐剂是白油佐剂。

9.根据权利要求7所述的一种用于预防Ⅰ群4型禽腺病毒的重组亚单位疫苗，其特征在于，所述疫苗中的佐剂是白油佐剂。