[发明专利]一种基于核酸适配体-分子印迹荧光传感器的细胞色素c的检测方法

说明书

本发明提供一种基于核酸适配体‑分子印迹荧光传感器的细胞色素c的检测方法包括以下步骤：S1：核酸适配体‑分子印迹荧光传感器的制备；S2：绘制“荧光淬灭强度‑细胞色素c浓度”标准工作曲线，算出工作方程；S3：测定样品中的细胞色素c的含量。本发明的检测方法利用了一种以双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点为信号元件，再包裹上核酸适配体‑分子印迹聚合物层的具有对细胞色素c双重识别功能的核酸适配体‑分子印迹荧光传感器，实现了对细胞色素c高选择性、高灵敏性的检测。本发明的检测方法对细胞色素c的线性检测范围为0.20‑2.00μmol/L，线性相关系数为0.9922，检测限为0.054μmol/L，专一性识别因子为3.28。

技术领域

本发明属于生物医学分析化学领域，具体涉及一种一种基于核酸适配体-分子印迹荧光传感器的细胞色素c的检测方法。

背景技术

细胞色素c(Cytochrome c，Cyt c)是一种以铁卟啉为辅基的可溶性色素蛋白，普遍存在于生物体中，是构成细胞呼吸链的主要成员之一。作为细胞凋亡的信息物质，细胞色素c在研究细胞凋亡过程的病理学、药理学以及线粒体变化的过程中具有非常重要的作用。目前，常用细胞色素c的检测方法为双抗夹心法。然而，抗体的物理和化学性质不稳定，在体外容易导致失活。抗体的筛选和生产过程繁琐，导致其生产成本高昂，对抗体在蛋白质检测中应用的发展受到限制。

核酸适配体是一种对靶物质有特异性识别能力的单链的核苷酸，有望成为抗体的替代物，在生物分析领域有巨大的应用潜力和多样性的应用范围。适配体在体外通过指数富集的配基系统进化技术筛选获得核酸序列，对目标物有高度的亲合力和特异性，因而非常适合用作识别探针。另外，核酸适配体有许多优点，如无毒、化学稳定性好、价格便宜、容易被修饰、序列设计灵活多变、无免疫原性及可以高亲和性和特异性得结合几乎任何目标分子如小分子、蛋白甚至微生物和细胞。

分子印迹聚合物作为一种识别元件，近年来获得了持续的关注，并广泛应用于纯化分离、化学/生物传感和药物递送等领域。由于其在空间和大小方面为模板分子量身定做了互补的结合位点，分子印迹聚合物能够高特异性和选择性的识别模板分子。相比于传统的识别元件，分子印迹聚合物制备成本低、物理稳定性好、可以多次循环使用。

考虑到适配体和分子印迹各自独特的优点，以及荧光纳米材料半导体量子点具有荧光颜色可调、发射峰窄而对称、激发波长范围大等特点。因此，本发明通过使用以半导体量子点作为支撑、巯基修饰的核酸适配体和甲基丙烯酸为功能单体的分子印迹聚合物来建立一种对细胞色素c具有高选择性、高灵敏的检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术所存在的不足，提供一种基于核酸适配体-分子印迹荧光传感器的细胞色素c的检测方法，其步骤简单，能快速、灵敏和专一性的检测样品中的细胞色素c的含量。

为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

一种基于核酸适配体-分子印迹荧光传感器的细胞色素c的检测方法包括以下步骤：

S1：核酸适配体-分子印迹荧光传感器的制备

首先，由模版分子细胞色素c、巯基修饰的细胞色素c核酸适配体、甲基丙烯酸和交联剂形成预聚合复合物；然后，由预聚合复合物、双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点和引发剂形成核酸适配体-量子点复合物；最后，将核酸适配体-量子点复合物中模版分子细胞色素c洗脱，得到核酸适配体-分子印迹荧光传感器；

S2：绘制“荧光淬灭强度-细胞色素c浓度”标准工作曲线，算出工作方程

将步骤S1制备的核酸适配体-分子印迹荧光传感器分散在pH值为7-8的磷酸缓冲液中，再分别与一系列浓度梯度的细胞色素c溶液混合，在温度为20-30℃条件下，震荡至少50分钟，测试其在595nm处的荧光强度；根据细胞色素c浓度和595nm处的荧光强度，绘制“荧光淬灭强度-细胞色素c浓度”标准工作曲线，算出工作方程；