[发明专利]一种基于核酸适配体-分子印迹荧光传感器的细胞色素c的检测方法

权利要求书

1.一种基于核酸适配体-分子印迹荧光传感器的细胞色素c的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：核酸适配体-分子印迹荧光传感器的制备

首先，由模版分子细胞色素c、巯基修饰的细胞色素c核酸适配体、甲基丙烯酸和交联剂形成预聚合复合物；然后，由预聚合复合物、双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点和引发剂形成核酸适配体—量子点复合物；最后，将核酸适配体—量子点复合物中模版分子细胞色素c洗脱，得到核酸适配体-分子印迹荧光传感器；

S2：绘制“荧光淬灭强度-细胞色素c浓度”标准工作曲线，算出工作方程

将步骤S1制备的核酸适配体-分子印迹荧光传感器分散在pH值为7-8的磷酸缓冲液，再分别与一系列浓度梯度的细胞色素c溶液混合，在温度为20-30℃条件下，震荡至少50分钟，测试其在595nm处的荧光强度；根据细胞色素c浓度和595nm处的荧光强度，绘制“荧光淬灭强度-细胞色素c浓度”标准工作曲线，算出工作方程；

S3：测定样品中的细胞色素c的含量

将步骤S1制备的核酸适配体-分子印迹荧光传感器分散在pH值为7-8的磷酸缓冲液中，再样品溶液混合，在温度为20-30℃条件下，震荡至少50分钟，测试其在595nm处的荧光强度；将所得荧光强度数值带入工作方程得到样品中的细胞色素c的含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1包括以下步骤：

1)制备预作用复合物

将模版分子细胞色素c、巯基修饰的细胞色素c核酸适配体溶解于磷酸缓冲液中，再加入甲基丙烯酸和交联剂，在温度为37℃的条件下，反应12小时，制得预作用复合物；

2)制备核酸适配体—量子点复合物

向步骤1)获得的预作用复合物通入氮气20分钟，排除空气，加入双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点和引发剂，再加入磷酸缓冲液，在温度为37℃、氮气保护的条件下，反应12小时，制得核酸适配体—量子点复合物；

3)洗脱模版分子细胞色素c

将步骤2)获得的核酸适配体—量子点复合物在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，用洗脱液除去核酸适配体—量子点复合物中的模版分子细胞色素c，得到核酸适配体-分子印迹荧光传感器。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述巯基修饰的细胞色素c核酸适配体的序列为5’-HS-(CH₂)₆-CCGTGTCTGGGGCCGACCGGCGCATTGGGTACGTTGTTGC-(CH₂)₆-SH-3’。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述模版分子细胞色素c、巯基修饰的细胞色素c核酸适配体和甲基丙烯酸的摩尔比为1:1:(80-120)。

5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点由以下步骤制备所得：

(1)取巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点与体积分数为50％的乙醇混合，搅拌15分钟，再加入正硅酸乙酯和氨水，搅拌反应2小时，继续加入KH570，反应4小时；

(2)步骤(1)的反应液在转速为12000rpm的条件下离心10分钟，去掉上清液，分别用乙醇和水洗涤数次，得到双键修饰的锰掺杂硫化锌量子点；

所述巯基丙酸修饰的锰掺杂硫化锌量子点、乙醇、正硅酸乙酯、氨水和KH570的摩尔体积比为1mol:(310-315)L：(1.2-1.3)L：(2.5-2.6)L：(0.12-0.13)L。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S2包括以下步骤：

将步骤S1制备的核酸适配体-分子印迹荧光传感器分散在pH值为7.5的磷酸缓冲液中，再分别与一系列浓度梯度的细胞色素c溶液混合，在温度为25℃条件下，震荡80-100分钟，测试其在595nm处的荧光强度；根据细胞色素c浓度和595nm处的荧光强度，绘制“荧光淬灭强度-细胞色素c浓度”标准工作曲线，算出工作方程。