[发明专利]一种HIV-1衣壳蛋白抑制剂高通量筛选模型的建立方法

说明书

本发明提供一种HIV‑1衣壳蛋白抑制剂高通量筛选模型的建立方法,该方法包括模型的建立、模型的验证、阴性对照模型建立等步骤，该方法基于均相时间分辨荧光的原理，利用带有GST融合标签的HIV‑1衣壳蛋白C末端CA‑CTD和生物素化的多肽CAI，分别结合带有荧光基团的受体steptavidin‑XL665微珠和供体anti‑GST‑Cryptate微珠，使用荧光激发，当CA‑CTD与CAI相互作用时，发生共振能量转移，诱发受体分子发出荧光，当抑制剂分子阻断CA‑CTD与CAI的相互作用时，荧光将会减弱，因此，通过荧光的强弱可以判断出化合物是否具有抑制CA的作用。

技术领域

本发明属于医药领域，具体的涉及一种构建HIV-1衣壳蛋白抑制剂的高通量筛选模型的方法。

背景技术

HIV-1病毒具有特殊的病毒颗粒结构，是由病毒衣壳蛋白(capsid protein，CA)形成的一个蛋白质外壳包绕着内部的核蛋白复合体构成。其与靶细胞融合后，迅速脱去糖蛋白外壳，将遗传物质释放到宿主细胞的细胞质中进行复制，在这个过程中脱壳是感染宿主细胞的重要步骤，脱壳不成功就会导致逆转录的失败。如果衣壳蛋白受到抑制，HIV-1几乎不能感染宿主细胞。CA在HIV-1复制过程中的重要作用使其成为研发抗HIV药物的一个新型作用靶点。研究发现，结合CA蛋白C末端(C-terminal domain，CTD)的化合物可阻断CA蛋白的组装，起到抑制病毒复制的作用。

目前，靶向CA蛋白CTD的CA抑制剂筛选方法主要有以下三大类：1、双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation，BiFC)Lampel等根据双分子荧光互补的原理，先将红色荧光蛋白mCherry在159/160残基位点切开，然后CA-CTD蛋白分别与的mCherry的N末端和C末端的融合表达。mCherry的N末端和C末端在大肠杆菌内共表达时，不会自发组装成完整的荧光蛋白，在激发光的激发下，不能产生荧光。但是，当在大肠杆菌体内共表达融合蛋白的时候，由于CA-CTD之间的相互作用，mCherry的两个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光分子，在激发光的激发下，产生mCherry的红色荧光，从而实现对CA-CTD分子间相互作用或样品抑制活性的评价(Lampel A,et al.Targetingthe Early Step of Building Block Organization in Viral Capsid Assembly.ACSchemical biology,2015,10(8):1785-1790)。该方法的缺点是：耗时长、步骤繁琐，对检测设备和人员要求较高。2、噬菌体展示(phage display)Sticht等利用液相噬菌体展示技术，使用M13噬菌体12肽库，以CA蛋白为包被的抗原，筛选能够结合CA蛋白的多肽抑制剂，最终得到了一个结合CA-CTD的活性肽CAI。该方法可以用于蛋白的多肽的筛选(Sticht J,etal.A peptide inhibitor of HIV-1assembly in vitro.Nature Structural andMolecular Biology,2005,12(8):671)。该方法的缺点：耗时长，步骤非常繁琐，对检测人员要求较高，假阳性多，通量低。3、放大化学发光亲和均相检测(amplified luminescentproximity homogeneous assay，ALPHA)Machara等利用ALPHA技术的原理，利用带有GST融合标签的HIV-1衣壳蛋白(capsid，CA)C末端(CA-CTD)和生物素化的多肽CAI，分别结合包被链霉亲和素的供体微珠和包被有谷胱甘肽的受体微珠。当激发光(波长为680纳米)激发时，如果CA-CTD与CAI发生了相互作用，供体微珠上的光敏剂将周围环境中的氧气转化为更为活跃的单体氧。单体氧扩散至受体微珠，与其上的化学发光剂反应，进一步激活了同样在受体微珠上的荧光基团，使之发出荧光，波长为520～620nm。单体氧的半衰期为4微秒，在溶液中的扩散距离为200纳米左右。如果生物分子不存在特异的相互作用，单体氧无法扩散到受体微珠，则不会有荧光信号产生。该方法可以实现对CA-CTD分子间相互作用或样品抑制活性的评价(Machara A,et al.Specific inhibitors of HIV capsid assembly bindingto the C-terminal domain of the capsid protein:evaluation of 2-arylquinazolines as potential antiviral compounds.Journal of medicinalchemistry,2016,59(2):545-558)。该方法的缺点：成本昂贵，对检测设备要求高，限制了方法的推广应用。时间分辨荧光技术(time-resolved fluorescence，TRF)是基于镧系元素铕(Eu)、钐(Sm)、镝(Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕鳌合物供体与受体之间距离小于10nm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均相时间分辨荧光(Homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF)技术是法国Cisbio公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短一般为几毫秒(一般为几毫秒)，为了避免短暂的荧光干扰，公司利用较长荧光寿命的镧系鳌合物作为荧光能量供体，受体经过别藻蓝蛋白(allophycocyanin)或荧光素修饰，供体在能量转移时就可以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消失时间成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧光引起的背景干扰。