[发明专利]人血清中25羟基维生素D的检测方法

权利要求书

1.一种人血清中25羟基维生素D的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

样品前处理：取人血清样品，加入含有25羟基维生素D内标物的甲醇溶液，然后向所述人血清样品中加入硫酸锌水溶液和甲醇进行蛋白沉淀，充分混匀后加入正己烷溶剂进行萃取，再充分混匀后离心，取上清液并进行干燥后加入复溶液，得到待测样品；

样品检测：对所述待测样品用超高效液相色谱串联四极杆质谱仪进行检测，

其中，超高效液相色谱的条件包括：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 Column,2.1×50mm,1.8μm；

色谱柱温度：37℃-43℃；

进样量：18-22uL；

流速：0.42-0.48mL/min；

流动相：流动相A为含有1.8-2.2mM醋酸铵和0.09-0.11v/v％甲酸的水溶液，流动相B为含有1.8-2.2mM醋酸铵和0..09-0.11v/v％甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱；

所述25羟基维生素D为25羟基维生素D2和/或25羟基维生素D3，所述25羟基维生素D内标物为3d-25羟基维生素D2和/或6d-25羟基维生素D3。

2.根据权利要求1所述的人血清中25羟基维生素D的检测方法，其特征在于，超高效液相色谱的条件包括：

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 Column,2.1×50mm,1.8μm；

色谱柱温度：40℃；

进样量：20uL；

流速：0.45mL/min；

流动相：流动相A为含有2mM醋酸铵和0.1％甲酸的水溶液，流动相B为含有2mM醋酸铵和0.1％甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱。

3.根据权利要求1所述的人血清中25羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的条件如下：

4.根据权利要求1所述的人血清中25羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述超高效液相色谱串联四极杆质谱仪的超高效液相色谱采集窗口为2.30-2.70min。

5.根据权利要求1-4任一项所述的人血清中25羟基维生素D的检测方法，其特征在于，质谱条件包括：

6.根据权利要求5所述的人血清中25羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述质谱条件还包括：所述25羟基维生素D2的检测离子对为413.3>395.2和413.3>83.1，其中413.3>395.2为定量离子对；所述25羟基维生素D3的检测离子对为401.3>383.2和401.3>159.1，其中401.3>383.2为定量离子对；所述3d-25羟基维生素D2的定量检测离子对为416.35>358.3；所述6d-25羟基维生素D3的定量检测离子对为407.35>159.1。

7.根据权利要求6所述的人血清中25羟基维生素D的检测方法，其特征在于，检测离子对对应的锥孔电压和碰撞能量如下：

8.根据权利要求1-4任一项所述的人血清中25羟基维生素D的检测方法，其特征在于，依据25羟基维生素D2和/或25羟基维生素D3的保留时间以及相对离子丰度比判断所述人血清样品中是否存在25羟基维生素D2和/或25羟基维生素D3，所述相对离子丰度比为各待测目标物的定性离子对的峰面积与定量离子对的峰面积的比值，所述待测目标物包括25羟基维生素D2和/或25羟基维生素D3。

9.根据权利要求1-4任一项所述的人血清中25羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述含有25羟基维生素D内标物的甲醇溶液的浓度为248-252ng/mL，及/或，所述硫酸锌水溶液的浓度为0.15-0.25mol/L；及/或，

所述复溶液为甲醇和水的混合物，所述甲醇和水的体积比为63-67：33-37。

10.根据权利要求9所述的人血清中25羟基维生素D的检测方法，其特征在于，所述人血清样品与所述含有25羟基维生素D内标物的甲醇溶液的体积比为1：0.15-0.25；及/或，

所述人血清样品与所述硫酸锌溶液、甲醇、正己烷溶剂的体积比为1：1：1.8-2.2：8-12；及/或，

所述上清液与正己烷溶剂的体积比为1：1.1-1.3；及/或，

所述复溶液与所述人血清样品的体积比为2-3：2。