[发明专利]一种谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的构建及应用

说明书

本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的构建及应用。本发明提供的谷氨酸棒杆菌表达系统包括一种表达载体和宿主菌：其中表达载体依次包括谷氨酸棒杆菌组成型启动子PglyA、半乳糖苷酶LacZ、乳糖通透酶LacY、T7RNA聚合酶启动子PT7；表达宿主菌含有来源于大肠杆菌Bl21(DE3)的T7RNA聚合酶。本发明的实验证明，本发明的乳糖诱导表达系统可以使谷氨酸棒杆菌利用乳糖作为诱导剂高效表达外源基因，避免了传统表达系统只能利用IPTG作为诱导剂的局限，在以糖质为原料的大规模发酵生产中具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的构建及应用。

背景技术

谷氨酸棒杆菌是一种重要的工业生产菌株，是美国FDA认定的安全(generallyrecognized as safe，GRAS)菌株，广泛应用于生产氨基酸、泛酸、类胡萝卜素、有机酸等产品。同时，谷氨酸棒杆菌也是一种优良蛋白表达宿主。目前谷氨酸棒杆菌中重组蛋白表达中使用最为广泛的启动子元件为来源于大肠杆菌的Ptac启动子。但由于谷氨酸棒杆菌基因组中缺少负责编码乳糖转运的通透酶(LacY)和乳糖水解的半乳糖苷酶(LacZ)的基因，因此，目前在谷氨酸棒杆菌中，不能通过添加乳糖而只能通过添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)来诱导Ptac启动子的表达。IPTG虽然具有不被细胞代谢的优点，但由于其价格相对较高且对细胞有潜在的毒性，大大限制了其在工业化生产中的的大规模使用。

T7表达系统是一种被广泛应用在大肠杆菌中表达蛋白的强启动子调控的表达系统。虽然目前已有人将IPTG诱导的T7表达系统引入谷氨酸棒杆菌MB001中，其调控效果和表达水平与Ptac启动子相比均有较大提高，但该表达系统还是依赖IPTG诱导启动子的表达，仍没有解决诱导剂的问题(Microbial Biotechnology，2015，8，253-265)。所以开发一种能够利用乳糖进行诱导的高效、廉价、安全的谷氨酸棒杆菌重组蛋白表达系统具有非常重要的实际应用价值。

目前，已有人在谷氨酸棒杆菌R163等菌株中探究了其利用乳糖的情况(ArchMicrobiol，1991，155，607-612；Applied and Environmental Microbiology，2004，70，2861-2866)，但并未见在谷氨酸棒杆菌中利用乳糖作为诱导剂诱导重组蛋白表达的报道。

因此，本专利尝试在谷氨酸棒杆菌13032中，引入lacZ和lacY基因，并利用T7启动子，构建一种可利用乳糖进行诱导的谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统。

发明内容

本发明一个目的是提供一种利用乳糖诱导的谷氨酸棒杆菌表达目的蛋白试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括谷氨酸棒杆菌、乳糖诱导系统和驱动目的蛋白编码基因表达的T7表达系统；

所述T7表达系统包括T7RNA聚合酶基因、目的蛋白的编码基因和驱动所述目的蛋白编码基因表达的T7启动子；

所述乳糖诱导系统包括LacY基因和LacZ基因及驱动LacY基因和LacZ基因表达的启动子。

上述试剂盒在制备表达目的蛋白的重组谷氨酸棒杆菌中的应用也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供一种表达目的蛋白的重组谷氨酸棒杆菌。

本发明提供的重组谷氨酸棒杆菌，包括乳糖诱导系统和驱动目的蛋白编码基因表达的T7表达系统；

所述T7表达系统包括T7RNA聚合酶基因、目的蛋白的编码基因和驱动所述目的蛋白编码基因表达的T7启动子；

所述乳糖诱导系统包括LacY基因和LacZ基因及驱动LacY基因和LacZ基因表达的启动子。