[发明专利]一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法

权利要求书

1.一种乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，收集待测样品，去脂肪，制成去脂肪样品溶液；

S2，乳制品前处理

将无水乙醇、氨水和石油醚分别加入到样品溶液中，混匀，得到的混合物离心，弃去上清液，将沉淀溶于10mmol/L的TE缓冲液中，得到去脂肪样品溶液；其中，无水乙醇、氨水、石油醚、样品溶液和TE缓冲液的体积比例为1：1：1：25：1；

S3，制备纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片

将纳米氢氧化钛和纳米氢氧化锆按照1～5:1～5的质量比例混合后溶解在10g/100ml的SDS溶液中，且SDS溶液的溶剂为10mmol/L、pH＝7.8的TE缓冲液，溶质为SDS；除菌，得到无菌纳米氢氧化钛/氢氧化锆溶液；制备滤纸圆片，灭菌，浸泡于无菌纳米氢氧化钛/氢氧化锆溶液中，充分浸湿滤纸圆片，干燥，用超纯水清洗滤纸圆片，再次干燥，得到纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片；

S4，制备纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片处理样品

向去脂肪样品溶液加入0.25倍体积的乙酸乙酯，混匀，离心，去掉上清液，沉淀用灭菌超纯水悬浮，加入所述纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定滤纸圆片，充分浸湿，取出滤纸圆片干燥；将干燥的纳米氢氧化钛/氢氧化锆固定的滤纸圆片浸入到灭菌的10g/100ml的SDS溶液中，搅拌，取出滤纸圆片并放入到10mmol/L、pH＝7.8的TE缓冲液中，搅拌，用无菌去离子水清洗滤纸圆片两次；清洗过后的滤纸圆片再次干燥，得到金黄色葡萄球菌吸附滤纸；

S5，提取金黄色葡萄球菌DNA

将金黄色葡萄球菌吸附滤纸浸泡在含有牛血清白蛋白的蛋白溶液中，加入0.05mg/ml鲑鱼精DNA溶液和去离子水；沸水浴，得到的细胞裂解物冰上冷却至室温，离心，取上清并加入等量体积4℃预冷的无水乙醇，离心，弃去上清液，保留沉淀的DNA，加入无菌去离子水溶解沉淀的DNA，得到DNA模板，备用；

S6，PCR检测

PCR检测使用的引物序列为：

nuc1：5’-gcagatttacgagatagaggaaca-3’

nuc2：5’-tttatgtggttatttcctgac-3’

如果获得的PCR检测产物片段为827bp，则结果为阳性。

2.根据权利要求1所述的乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，其特征在于，S1的具体步骤为：如果待测乳品为生牛乳，则直接作为样品溶液备用；如果待测乳品为乳粉，则将乳粉与灭菌超纯水混合按照1g：1ml的比例混合均匀，至固体彻底溶解，得到均质液，作为样品溶液备用；如果待测乳品为奶酪，则将奶酪磨碎，加入2g/100ml柠檬酸钠溶液，混合均匀制成均质液，作为样品溶液备用，其中奶酪与柠檬酸钠溶液的比例为25g：90ml。

3.根据权利要求1所述的乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，其特征在于，所述去脂肪的具体步骤如下：将无水乙醇、浓氨水和石油醚分别加入到待测样品中，混匀，得到的混合物12000gpm离心5min，弃去上清液，将沉淀溶于10mmol/L、pH＝8的TE缓冲液中，得到去脂肪样品溶液；其中无水乙醇、浓氨水、石油醚、待测样品、TE缓冲液的体积比例为1：1：1：25：1。

4.根据权利要求1所述的乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，其特征在于，S2中离心的条件为12000gpm离心5min，TE缓冲液的pH＝8。

5.根据权利要求1所述的乳品中金黄色葡萄球菌的快速检测方法，其特征在于，S3中，纳米氢氧化钛的粒径为100-200nm，纳米氢氧化锆的粒径为50-100nm。