[发明专利]一种Bacteroides xylanisolvens的筛选培养基及其应用

权利要求书

1.一种分离筛选菌群中Bacteroides xylanisolvens的方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：

(1)涂布分离：菌群样品用无菌生理盐水梯度稀释后，取100μL涂布于分离培养基，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48-72小时；

(2)一级纯化培养：挑取培养基颜色变黄区域的单菌落，在新的分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48-72小时；

(3)二级纯化培养：挑取一级培养单菌落，在新的分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48-72小时；

(4)三级纯化培养：挑取二级培养单菌落，接种于5-10mL生长培养基的试管中，37℃厌氧恒温培养箱培养24-48小时；

(5)菌种保存：将三级菌悬液与40％-50％的无菌甘油溶液均匀混合，使甘油终浓度为20％以上，将混合溶液分装在已灭菌的冻存管中，冻存于-80℃超低温冰箱内，备用；

(6)菌种鉴定；

所述分离培养基包括如下组分：唯一碳源木聚糖4-6g/L，胰蛋白胨15-25g/L，酵母提取物4-6g/L，氯化钠4-6g/L，磷酸氢二钾0.04-0.06g/L，磷酸二氢钾0.04-0.06g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，氯化血红素0.005-0.01g/L，维生素K1 0.001-0.002g/L，产酸指示剂溴甲酚紫0.010-0.014g/L，浓度为15-25mg/mL的卡那霉素硫酸盐溶液4-5mL/L，浓度为2-4mg/mL的万古霉素盐酸盐溶液2.0-2.5mL/L，琼脂15-20g/L，余量为无菌水，pH值为6.8-7.0；

所述生长培养基包括如下组分：脑心浸液液体培养基，半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，氯化血红素0.005-0.01g/L，维生素K1 0.001-0.002g/L，余量为无菌水。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中用于梯度稀释的生理盐水，其制备方法为：按比例称量氯化钠9g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，均匀溶解于蒸馏水中，用氢氧化钠溶液调节培养基pH值至6.8-7.0后，115-121℃下灭菌15-20分钟。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(5)中所述的40％-50％的无菌甘油溶液，其制备方法为：按纯甘油与蒸馏水的体积比为1:1-1:1.5混合后，添加半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，115-121℃下灭菌15-20分钟。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(6)中菌种鉴定的方法为：

(6.1)将三级菌悬液于10000rpm离心1分钟，弃上清，菌泥用无菌水等量重悬，作为PCR模板；

(6.2)所用PCR引物为16S rRNA通用引物：27F-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA，1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT，扩增片段长度为1500-1600bp；

(6.3)PCR体系为：27F引物溶液1μL，1492R引物溶液1μL，2X Taq Mastermix Dye 25μL，无菌水22.5μL及模板0.5μL；

(6.4)PCR体系混合均匀后，进行扩增反应，反应条件为：95℃，5min；30个循环：95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；

(6.5)所得PCR产物交由生物公司测序，将得到的序列结果使用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在GeneBank中进行搜索和相似性比对。