[发明专利]一种积累几丁寡糖重组枯草芽孢杆菌及其应用

说明书

本发明公开了一种积累几丁寡糖重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。本发明是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)作为表达宿主，通过过表达来源于百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)的N‑乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶编码基因nodC，得到了积累几丁寡糖枯草芽孢杆菌基因工程菌，产量达到136mg/L，其中，几丁三糖、几丁四糖和几丁五糖的含量分别为8mg/L，28mg/L和100mg/L，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产几丁寡糖奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种积累几丁寡糖重组枯草芽孢杆菌及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

几丁寡糖是由N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接起来的低聚合度水溶性甲壳低聚糖，是几丁质经水解生成的一类低聚物。与几丁质相比，几丁寡糖具有更高的水溶性，很容易被吸收利用，它们不仅具有几丁质的部分相似性质，而且一些功能性质更加显著。据报道，几丁寡糖具有抗菌活性、抗肿瘤活性、抵抗细菌侵染的防御能力、降低胆固醇的能力和促进钙吸收的能力、促进双歧杆菌增殖及强的吸湿保湿性能等性质，因此几丁寡糖在食品、医药、农业、日化用品等领域均具有广泛应用。目前，几丁寡糖的合成主要通过化学降解法和酶降解法，但前者需利用强酸或者强氧化剂处理，环境污染较为严重，而后者需要利用虾壳蟹壳为原料制备几丁质底物，易引起过敏反应，不适宜海鲜过敏的人群服用。

微生物细胞中存在着可能是最大数量的天然糖供体，利用微生物进行寡糖的生物合成，可直接或间接的利用天然糖供体进行目的寡糖的规模合成，使得许多天然或非天然的功能性寡糖的应用成为可能。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种被广泛用作食品酶制剂及重要营养化学品的生产宿主，其产品被FDA认证为“generally regarded assafe”(GRAS)安全级别。因此，运用代谢工程手段构建重组枯草芽孢杆菌是生产食品安全级几丁寡糖的有效途径。然而，枯草芽孢杆菌中氨糖代谢途径调控严密，且没有几丁寡糖合成关键基因，并不会形成几丁寡糖的积累。如何改造枯草芽孢杆菌中氨糖代谢途径，供需前体物质，以及建立几丁寡糖代谢途径是一个值得深入探讨的问题。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种积累几丁寡糖的重组枯草芽孢杆菌，是将百脉根根瘤菌来源的N-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶编码基因(nodC)克隆到表达载体pP43NMK，然后转化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)，通过改造代谢途径，实现几丁寡糖的积累。

在本发明的一种实施方式中，所述N-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述N-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶的基因如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，采用载体pP43NMK表达N-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶nodC。

本发明的第二个目的是提供一种构建上述重组枯草芽孢杆菌的构建方法，包括如下步骤：

1)构建重组质粒：克隆百脉根根瘤菌来源的N-乙酰氨基葡萄糖糖基转移酶编码基因nodC，连接到重组表达质粒上；

2)构建产几丁寡糖重组枯草芽孢杆菌：将上述重组表达载体转化枯草芽孢杆菌，得到产几丁寡糖重组枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168；所述重组表达载体为pP43NMK。

本发明的第三个目的是提供一种应用上述重组枯草芽孢杆菌发酵生产几丁寡糖的方法，是应用所述积累几丁寡糖的重组枯草芽孢杆菌进行发酵，于35～37℃、200～220rpm下培养10～16h的重组枯草芽孢杆菌以5％的接种量转入发酵培养基，于35～37℃、180～220rpm条件下发酵36～54h。