[发明专利]一种有机磷降解活性纳米颗粒及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种有机磷降解活性纳米颗粒及其制备方法与应用。本发明通过构建表达β‑酮基硫解酶、乙酰乙酰CoA还原酶、有机磷酸酐水解酶与聚羟基脂肪酸酯合成酶的融合蛋白和有机磷酸酐水解酶与聚羟基脂肪酸酯结合蛋白的融合蛋白的工程菌，将获得的工程化有机磷酸酐水解酶通过共价和非共价两种方式联合固定于聚羟基脂肪酸酯纳米颗粒表面，通过发酵法一步高效生产具备有机磷降解活性的纳米颗粒；其具有较高的稳定性和可回收利用效果。相较于传统酶固定化方法，本发明无需分别制备酶蛋白和固定化载体，可一步法完成固定化颗粒的生产，生产成本低廉。本发明在果蔬农药残留净化与环境污染物治理方面具有广泛的用途。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种有机磷降解活性纳米颗粒及其生产工程菌株、发酵制备方法和应用。

背景技术

人类生产活动排放大量有机污染物，造成环境污染，威胁生态安全与人类健康。有机磷化合物是一类膦酸或氨基磷酸的酯或硫醇衍生物，通过与乙酰胆碱酯酶活性中心丝氨酸共价结合发挥毒力。自1937年首次合成以来，被广泛应用与人类战争及生产活动。二战期间G型和V型有机磷神经毒剂是重要化学武器，在现代工农业领域有机磷被广泛用作农药、阻燃剂、石油添加剂和增塑剂。世界有机磷化学武器总储存达20万吨，我国有机磷农药年需求量约为8万吨，占总农药使用量的一半以上，有机磷阻燃剂年需求量约为3万吨。有机磷化合物规模应用和排放对全球生态安全造成威胁，世界每年有近300万起因摄入有机磷化合物引发的中毒事件。传统物理(填埋、冲刷稀释等)、化学法(次氯酸、强碱等)修复环境有机磷污染存在无法彻底清除有机磷及引入二次污染的缺陷，而生物法利用活性菌剂或固定化酶等生物制剂可在温和条件下高效降解环境或食品有机磷残留，具有其他两种方法不可比拟的优势。目前研究较多的微生物有机磷降解酶主要包括三类：有机磷水解酶(organophosphorus h ydrolase，OPH)、甲基对硫磷水解酶(methyl parathionhydrolase，MPH)和有机磷酸酐水解酶(organophosphorous acid anhydrolase，OPAA)。申请人前期将海洋细菌来源的二肽酶在体外进化为有机磷酸酐水解酶，该突变酶对对氧磷和甲基对硫磷的水解效率常数分别提高了30.68倍和8837.71倍(专利申请号：CN201610705142.7)。

固定化酶往往具有较游离酶更优良的重复利用性和更高的稳定性，许多酶制剂以固定化酶的形式应用。常规酶的固定化是通过物理、化学方法将酶蛋白与固定化载体结合，蛋白与载体之间的连接方式包括共价结合、非共价结合和包埋等。常规酶的固定化需要分别制备游离酶蛋白和固定化载体，操作繁琐，成本相对高昂。因而，许多研究探索了一步发酵法制备固定化生物催化剂的方法，最普遍的做法是通过锚定蛋白将酶蛋白展示在微生物细胞(如大肠杆菌、酵母等)表面，获得的重组微生物细胞可作为固定化酶使用。近年还出现了将酶蛋白固定于芽孢杆菌属内生芽孢表面的研究(Highly active spore biocatalystby self-assembly of co-expressed anchoring scaffoldin and multimeric enzyme，doi:10.1002/bit.26492)。相对微米级微生物细胞，纳米级芽孢颗粒具有更高的比表面积，原则上可结合更多的酶蛋白。上述固定化酶发酵法制备技术中，酶蛋白与微生物细胞/芽孢表面结合主要依赖锚定蛋白与细胞/芽孢壁上的有机高分子物质间形成的非共价作用力。该非共价作用力易受环境因素(如表面活性剂、pH等)的影响而致酶蛋白与载体分离。