[发明专利]一种蛋鸭小卵泡膜细胞的分离提取方法

说明书

本发明公开了一种蛋鸭小卵泡膜细胞的分离提取方法，包括以下步骤：选取一只产蛋期蛋鸭，解剖剪取卵巢组织，分离出卵泡；剥离小卵泡外的结缔组织层，固定住卵泡后将小卵泡剪破，将卵泡膜翻转，卵泡膜内层朝上，刮除卵黄和颗粒细胞层；在卵泡膜层中加入Ⅱ型胶原蛋白酶消化液，进行消化处理；再次刮除上述的组织内外两面细胞，吹打、冲洗组织层；将冲洗干净的组织层置于新配置的Ⅱ型胶原蛋白酶消化液中，进行消化处理；将组织剪成碎片，进行消化处理；将混悬液用细胞网筛过滤，收集滤液，加入胎牛血清终止消化，离心收集细胞沉淀，制备得到蛋鸭小卵泡膜细胞。

技术领域

本发明属于家禽育种技术领域，具体地说，涉及一种蛋鸭小卵泡膜细胞的分离提取方法。

背景技术

家禽卵泡膜细胞是卵泡的重要组成部分，围绕在颗粒层外周的一层扁平细胞，其在卵泡发育过程中起着至关重要的作用。目前卵泡相关研究中，人们更多的关注是颗粒细胞而忽略了卵泡膜细胞。卵泡膜细胞体外培养技术是研究卵泡膜在卵泡发育中作用机制的关键。

现研究报道中，鲜有关于水禽小卵泡的卵泡膜细胞体外培养报道，这样，无法全面了解蛋鸭小卵泡卵泡膜细胞在卵泡发育中的生理过程。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种蛋鸭小卵泡膜细胞的分离提取方法，该方法细胞纯度高，活力好，分离密度高。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种蛋鸭小卵泡膜细胞的分离提取方法，包括以下步骤：

步骤1、选取一只产蛋期蛋鸭，解剖剪取卵巢组织，分离出3-6mm小卵泡，将小卵泡置于盛有灭菌PBS的培养皿中；

步骤2、用眼科镊剥离小卵泡外的结缔组织层，固定住卵泡后用眼科剪将小卵泡剪破，将卵泡膜翻转，卵泡膜内层朝上，用眼科镊刮除卵黄和颗粒细胞层；

步骤3、在卵泡膜层中加入Ⅱ型胶原蛋白酶消化液，置于干净的培养皿中，并放置在培养箱中进行消化处理；

步骤4、用镊子再次刮除步骤3中的组织内外两面细胞，吹打、冲洗组织层；

步骤5、将步骤4中冲洗干净的组织层置于新配置的Ⅱ型胶原蛋白酶消化液中，进行消化处理；

步骤6、将步骤5制备得到的组织剪成碎片，加入新配置的Ⅱ型胶原蛋白酶消化液进行消化处理；

步骤7、将混悬液用细胞网筛过滤，收集滤液，加入胎牛血清终止消化，离心收集细胞沉淀，制备得到蛋鸭小卵泡膜细胞。

可选地，所述步骤3中Ⅱ型胶原蛋白酶消化液与卵泡膜层的体积质量比(ml/g)为0.2％；消化时间为25-35min，消化温度为37℃。

可选地，所述步骤5中新配置的Ⅱ型胶原蛋白酶消化液与步骤4中冲洗干净的组织层的体积质量比(ml/g)为0.2％；消化时间为15-25min，消化温度为37℃，每隔5min吹打组织。

可选地，所述步骤6中新配置的Ⅱ型胶原蛋白酶消化液与步骤5制备得到的组织的体积质量比(ml/g)为0.2％；消化时间为35-45min，消化温度为37℃，每隔15min吹打组织。

可选地，所述步骤7中胎牛血清的体积浓度为10％，细胞筛网的目数为250目，离心转速为400g，离心时间10min。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明首次分离提取蛋鸭小卵泡膜细胞。

2)本发明通过多次消化、吹洗步骤减少了卵黄和颗粒细胞的污染，得到纯度高的膜细胞。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明