[发明专利]一种蛋鸭小卵泡膜细胞的分离提取方法

权利要求书

1.一种蛋鸭小卵泡膜细胞的分离提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、选取一只产蛋期蛋鸭，解剖剪取卵巢组织，分离出3-6mm小卵泡，将小卵泡置于盛有灭菌PBS的培养皿中；

步骤2、用眼科镊剥离小卵泡外的结缔组织层，固定住卵泡后用眼科剪将小卵泡剪破，将卵泡膜翻转，卵泡膜内层朝上，用眼科镊刮除卵黄和颗粒细胞层；

步骤3、在卵泡膜层中加入Ⅱ型胶原蛋白酶消化液，置于干净的培养皿中，并放置在培养箱中进行消化处理；其中Ⅱ型胶原蛋白酶消化液与卵泡膜层的体积质量比(ml/g)为0.2％；消化时间为25-35min，消化温度为37℃；

步骤4、用镊子再次刮除步骤3中的组织内外两面细胞，吹打、冲洗组织层；

步骤5、将步骤4中冲洗干净的组织层置于新配置的Ⅱ型胶原蛋白酶消化液中，进行消化处理；其中新配置的Ⅱ型胶原蛋白酶消化液与冲洗干净的组织层的体积质量比(ml/g)为0.2％；消化时间为15-25min，消化温度为37℃，每隔5min吹打组织；

步骤6、将步骤5制备得到的组织剪成碎片，加入新配置的Ⅱ型胶原蛋白酶消化液进行消化处理；其中新配置的Ⅱ型胶原蛋白酶消化液与步骤5制备得到的组织的体积质量比(ml/g)为0.2％；消化时间为35-45min，消化温度为37℃，每隔15min吹打组织；

步骤7、将混悬液用细胞网筛过滤，收集滤液，加入胎牛血清终止消化，离心收集细胞沉淀，制备得到蛋鸭小卵泡膜细胞。

2.根据权利要求1所述的分离提取方法，其特征在于，所述步骤7中胎牛血清的体积浓度为10％，细胞筛网的目数为250目，离心转速为400g，离心时间10min。