[发明专利]一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的电化学法拉第笼免疫传感器的构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种检测组蛋白乙酰转移酶活性的电化学法拉第笼免疫传感器的构建方法及应用，特点是包括以下步骤：(1)peptide/Au的制备：分别取乙酰转移酶p300与多肽、乙酰辅酶A在PBS(0.1M，pH 7.0)中充分混合，于恒温水浴锅中孵育。取催化反应液滴涂于金电极表面，4℃冰箱中孵育；(2)MBAuNPs@GO‑Ab的制备：将HAuCl₄，CTAB与水混合，向反应混合物中加入抗坏血酸，然后加入NaOH，得到CTAB覆盖的AuNPs，离心、纯化后分散在等量水中，再向溶液中加入GO超声分散，静置备用，随后加入乙酰基抗体孵育，最后加入MB震荡混合均匀；(3)电化学法拉第笼免疫传感器的制备：取MBAuNPs@GO‑Ab滴涂于peptide/Au表面，室温下孵育，随后将制得的传感器置于PBS(0.1M，pH 7.0)中进行电化学SWV测试。

技术领域

本发明涉及电化学免疫传感器，尤其是涉及检测组蛋白乙酰转移酶活性的电化学法拉第笼免疫传感器的构建方法及其在生物环境中的检测应用，属于功能材料和生物传感技术领域。

背景技术

癌症，也被称为恶性肿瘤，是当今人类社会的三大疾病之一，对人类健康的影响日趋显著。尽管关于恶性肿瘤的研究已经取得令人鼓舞的进展，但是关于恶性肿瘤的预防和治疗却不甚完善，还需要多学科交叉结合发展，进行深层次的研究。因此，发展新型的分析传感方法及平台，快速、高灵敏、多通道地动态监测癌症相关标志物及其发生发展过程，为癌症的预防、诊断、治疗以及预后执行提供方向。翻译后修饰(PTM)是细胞对蛋白质实行复杂调控和信息传递的基础，它不仅影响蛋白质的高级结构和生物活性，还调节其亚细胞定位、代谢周期以及与其它大分子物质的相互作用，癌症的发生发展与PTM密切相关。目前PTM相关酶分析方法主要集中于蛋白激酶，而对蛋白质乙酰化相关酶研究较少。2010年，Science杂志聚焦报道了乙酰化对代谢通路及代谢酶活性的调节，科学家们逐渐深入研究蛋白质乙酰化相关酶。组蛋白乙酰化反应多发生在核心组蛋白氨基酸碱性氨基酸集中区的特定赖氨酸残基上，其基本原理是将乙酰辅酶A(Ac-CoA)的乙酰基转移到赖氨酸的NH₃⁺上。组蛋白乙酰化水平是由组蛋白乙酰化转移酶(HAT)和去乙酰化酶(HDAC)协调决定的。乙酰化转移酶通过在组蛋白的氨基端赖氨酸残基上引入中性的乙酰基，使组蛋白与DNA间的空间位阻增大、静电引力减小，导致两者间亲和作用减弱，DNA易于解凝聚，染色质表现出具有活性的转录结构，有利于DNA模板与转录因子亲和，激活基因转录；相反，去乙酰化酶催化的去乙酰化作用，使带负电的DNA与带正电的组蛋白紧密结合，染色质表现出卷曲致密的阻抑结构，抑制基因转录，组蛋白的乙酰化行使染色质转录调控的开关功能。异常的组蛋白乙酰化/去乙酰化修饰影响到恶性肿瘤细胞生长、分化、凋亡、增殖相关基因的调控，从而往往导致恶性肿瘤的发生、增殖。因此，研究乙酰化相关酶活性对于理解癌症成因和进展具有重要的意义。此外，临床试验研究发现，乙酰化相关酶抑制剂对多种恶性肿瘤细胞有明显的抑制增殖和促进凋亡的作用，可以选择性地高效杀伤肿瘤细胞，在癌症治疗中具有诱人的前景。同时，组蛋白乙酰化修饰与疾病状态及化疗效应紧密相关，可以通过赖氨酸的乙酰化程度跟踪和判断癌症相关生理进程，如高复发风险、预后治疗和独立预测因子等。总之，乙酰化作用及修饰对肿瘤的筛查、诊断、治疗和预防方面有着重要的指导意义，基于乙酰化相关酶活性进行抗肿瘤药物的设计与筛选，为抗癌药物的开发和疾病治疗手段的发展提供了新方向。