[发明专利]大肠杆菌检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种大肠杆菌的核酸等温扩增检测引物、检测方法和试剂盒。本发明所述试剂盒是基于大肠杆菌rfbE基因发明，rfbE基因是编码大肠杆菌O抗原的特异合成酶，是鉴定大肠杆菌重要的依据，E.coli特异性rfbE基因设计特异性引物，引物具有较强的特异性，适合于大肠杆菌的检测。本发明针对大肠杆菌的rfbE基因，设计了4条特异性引物。该检测试剂盒由反应混合液、引物混合液、酶混合液、阳性质控品、样品处理液、培养基六部分组成。

技术领域

本发明涉及一种核酸等温扩增方法特异性检测样品中大肠杆菌核酸的试剂盒，属于大肠杆菌快速检测开发。

背景技术

检测样品中细菌的通常通过传统培养法，随着分子生物技术的发展，分子生物学在细菌检测中的应用越来越广泛。本发明是建立在分子生物学手段之上，能够弥补传统培养方法在检出时间上的缺陷，实现快速、准确检测样品。

发明内容

本发明试剂盒为实现快速检测大肠杆菌目的，提供以下试剂：反应混合液、引物混合液、酶混合液、阳性质控品、样品处理液、选择性培养基干粉。本发明所述反应混合液由Mg2+和dNTP、反应缓冲液等组成，所述引物混合液由4条引物混合而成，所述酶混合液为BstDNA聚合酶，阳性质控品为大肠杆菌重组质粒，所述样品处理液为核酸裂解液，所述选择性培养基干粉为每包胰蛋白胨(Tryptone)5g、酵母提取物(Yeast extract)2.5g、氯化钠(NaCl)5g、万古霉素(Vancomycin)10mg。

本发明提供了核酸等温扩增检测大肠杆菌的检测引物4条，利用该检测引物可以特异性的检测大肠杆菌。

本发明应用核酸等温扩增检测的4条引物其特征在于，由下列引物序列组成：

引物1：5’-GGCCAAGGATTAGCTGTACA-3’

引物2：5’-GCTAATCCTATAGCAGCGCCATGACGTTATAGGCTACAATTA-3’

引物3：5’-CTTTCCTTGTGGACTTGTAC-3’

引物4：5’-AGAACAAGCTGATGATTTTATATCCAAGACTGTTGATATTTT-3’

本发明提供一种快速检测食品中大肠杆菌的检测方法，其特征在于，对样品进行短时间选择性培养获得增菌液，高温裂解离心，然后通过核酸等温扩增的方法用上述检测引物对细菌基因组DNA进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。

所述增菌液为选择性培养基，所述选择性培养基为每500mL LB液体培养基含10mg万古霉素的选择性培养基。

所述的样品为大多数肉类、熟食，但不限于所述样品。将待测样品粉碎匀浆，称取1-2g匀浆样品，加入到5-10mL选择性培养基中，42℃摇床培养6-8小时增菌，低温10000-12000r/min离心5-10min，0.5mL样品处理液稀释，煮沸5-10min作为检测模板。

所述的通过核酸等温扩增的方法用上述检测引物对细菌基因组DNA 进行选择性扩增具体为：体系总体积20μL，包括2μL反应混合液、2μL引物混合液、0.5μL酶混合液、1μL细菌DNA、14.5μL灭菌双蒸水，反应条件为65℃恒温反应45-60min。本发明所述检测结果利用电泳检测，具体是与DNA loading buffer混合，2-5%琼脂糖凝胶电泳检测，经成像仪检测。有效结果为阳性对照呈梯状条带，具体是阳性对照出现梯状条带为必要条件，样品出现梯状条带则样品为大肠杆菌阳性，样品不出现梯状条带则样品为大肠杆菌阴性。