[发明专利]人工肺泡的制备方法

说明书

本发明公开了一种人工肺泡的制备方法。所述方法先将明胶水溶液通过微流控装置制备直径均一的明胶微球，通过自组装方法获得规则排列的明胶支架，加热使其紧密排列后灌注PU溶液，经冷冻干燥去除溶剂后，水浴法除去明胶模板，获得具有反蛋白石结构的三维多孔PU支架。然后将PU支架进行氨等离子体处理接枝氨基，通过EDC/NHS将肝素连接到氨基上，再加入VEGF，使VEGF结合于肝素上。最后将MRC‑5细胞旋转接种于VEGF修饰的PU支架上，按比例接种HUVECs和NL20细胞的混合细胞悬液，共培养后制得组织工程人工肺泡。本发明通过调控明胶溶液和聚氨酯浓度、水相和有机相的流速及通道直径，自组装温度和时间，有效调控制得的人工肺泡的直径在300微米左右。

技术领域

本发明涉及一种人工肺泡的制备方法，属于组织工程技术领域。

背景技术

肺作为人体的重要器官，承载着气体交换的功能，肺组织由1.5-4亿个肺泡组成，表面积达到70-80m²，在对人体提供氧气排出二氧化碳方面发挥着重要作用。

肺泡的大小通常在250微米左右，其中表面积的90％由I型肺泡细胞占据，II型肺泡细胞约占5％，其余由巨噬细胞和血管内皮细胞共同占据。然而，很多疾病如肺癌、慢阻肺、肺动脉高压等会对肺部造成不可逆转的损伤。肺移植是目前应用较多的治疗技术，但是极为有限的供体数量，昂贵的手术费用，以及术后生存期较短等极大地限制了肺移植。

组织工程技术的出现使得肺修复成为可能。但是由于肺部组织结构复杂，肺泡形态特殊，人工肺泡的制备是一项难题。目前有些研究将非灵长类动物的肺组织进行去细胞化处理，获得具有完整肺部构造的三维支架作为肺组织工程的支架。但是迄今还没有可以用体外支架制备技术来制备人工肺泡的研究。

发明内容

针对肺部疾病造成的肺组织不可逆修复，肺移植供体不足，治疗方法极为有限的问题，本发明提供一种简便易行、尺寸可控的人工肺泡的制备方法，该方法是由组织工程三维反蛋白石结构支架、生长因子VEGF、肺细胞、内皮细胞和上皮细胞共培养组成。

本发明的技术方案如下：

人工肺泡的制备方法，以三维多孔反蛋白石结构支架为基础，修饰并缓释VEGF，依次接种肺细胞、内皮细胞和上皮细胞，培养3周后获得模拟肺泡结构的组织工程肺泡，具体步骤如下：

步骤1，配制浓度为3～10wt/v％的明胶溶液，采用微流控技术制备明胶微球，将明胶微球置于模具中，自组装排列粘结成型后得到明胶模板；

步骤2，将明胶模板浸渍在浓度为10～20wt/v％的聚氨酯(PU)的1,4-二氧六环溶液中，置于-20℃冷却，冷冻干燥后除去1,4-二氧六环，得到明胶/PU复合物；

步骤3，将明胶/PU复合物置于≥45℃水浴下，搅拌溶解去除明胶微球，得到PU三维多孔反蛋白石结构支架；

步骤4，将PU三维多孔反蛋白石结构支架进行氨等离子体处理，75％酒精浸泡，干燥后置于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)和肝素(Heparin)的混合溶液中，室温下孵育，PBS清洗后，再浸泡在VEGF溶液中，4℃下孵育，得到PU-VEGF支架；

步骤5，20～30rpm转速下，将人胚肺细胞(MRC-5)悬液旋转接种至PU-VEGF支架上，然后将人脐静脉内皮细胞(HUVECs)与人支气管上皮细胞(NL20)悬液接种至已接种MRC-5细胞的PU-VEGF支架上，培养至少3周，得到人工肺泡。