[发明专利]一种单分子测序芯片及其制备方法

说明书

本发明提供了一种单分子测序芯片及其制备方法，所述芯片包括流道板、基板和盖板，所述流道板设置在基板和盖板之间；所述流道板上设置流通池，所述流通池包括多个平行设置的流道；所述流通池的上方设置盖板、流通池的下方设置基板；所述流道的底部与基板表面连通；与流道板接触的所述基板的表面固定测序引物和定位用荧光标记物。该芯片表面负载有荧光寿命长、荧光强度高，荧光性能稳定的量子点或荧光微球，可以在测序过程中对目标DNA单分子进行定位。由于量子点或荧光微球在经过很多次的激发光照后仍然能够保持较高的荧光强度，解决了定位荧光信号无法长时间保持的问题，显著提高单分子测序读长，降低测序的错误率，并有效降低测序成本。

技术领域

本发明涉及测序芯片的设计制备技术领域，具体涉及一种单分子测序芯片及其制备方法。

背景技术

虽然二代测序技术在目前的测序市场上仍然占据主导地位，但是被称为第三代测序技术的单分子测序技术发展十分迅速。三代DNA测序主要包括单分子合成测序(Single-Molecule Sequencing by Synthesis，SMSBS)，单分子实时测序(Single-Molecule Real-Time Sequencing，SMRTS)和纳米孔测序(Nanopore Sequencing)三种技术。其中单分子合成测序技术(Helicos称为SMS技术)^3-5的基本原理与二代合成测序(SBS)相似，都是使用荧光标记形成的四种核苷酸依次在DNA引物上进行单碱基延伸，再经过高灵敏荧光成像技术检测被延伸引物的荧光信号从而识别待测模板上相应位置的碱基，然后去除荧光基团，并依次重复上述测序循环过程，从而实现DNA序列的测定。这种单分子测序技术原则上无需对待测DNA样本进行扩增，从而避免了由于DNA扩增放大而带来的GC偏好等误差，可以在单分子水平上直接读取原始的待测DNA序列信息，检测灵敏度高，样品制备简单。从而实现了低成本、高通量的直接测序。

DNA测序芯片是DNA测序的核心技术之一，也是测序仪的重要组成部分。单分子测序芯片目前尚未形成规模化生产，由于在进行单分子测序时，探测的对象是单个DNA分子，精细程度高，样品台或芯片的轻微振动都有可能引起目标DNA无法锁定，测序无法继续进行的严重问题。现有的单分子测序技术通过在待测模板上标记荧光分子来实现定位，每一个测序循环都需要对该标记的定位荧光分子进行成像，经过多次激发后很容易发生荧光淬灭，即使在添加抗荧光淬灭剂以及成像试剂的情况下也无法长时间保持。目前单分子合成测序平均读长只有25-30，定位荧光分子淬灭是一个重要原因。如果在单分子测序芯片表面负载特定排列的荧光寿命长、荧光强度高的其他荧光标记物以取代在待测模板上标记荧光用于定位，将有望解决上述问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对现有技术不足，提供一种单分子测序芯片及其制备方法，该方法工艺简单，成本较低，采用该方法制备的单分子测序芯片能够满足单分子测序对定位荧光信号检测的要求，其表面负载荧光性能良好的荧光标记物，尤其是能对目标DNA单分子进行定位，从而提高单分子测序的读长和准确性，具有十分重要的意义和很高的应用价值。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种单分子测序芯片，包括流道板、基板和盖板，所述流道板设置在基板和盖板之间；所述流道板上设置流通池，所述流通池包括多个平行设置的流道；所述流通池的上方设置盖板、流通池的下方设置基板；所述流道与基板表面连通。

优选地，与流道板接触的所述基板的表面固定测序引物和定位用荧光标记物。

优选地，所述引物为5′为-N3或5′-炔基修饰的引物；所述定位用荧光标记物为荧光量子点、纳米碳点和荧光微球中的一种，所述定位用荧光标记物的发光波长与标记在测序试剂上的荧光素波长不同即可。