[发明专利]一种单分子测序芯片及其制备方法

权利要求书

1.一种单分子测序芯片，其特征在于，包括流道板、基板和盖板，所述流道板设置在基板和盖板之间；所述流道板上设置流通池，所述流通池包括多个平行设置的流道；所述流通池的上方设置盖板、流通池的下方设置基板；所述流道的底部与基板表面连通；

与流道板接触的所述基板的表面固定测序引物和定位用荧光标记物；

引物为5′为-N3或5′-炔基修饰的引物；所述定位用荧光标记物为荧光量子点、纳米碳点和荧光微球中的一种；

在所述基板表面固定测序引物和定位用荧光标记物的方法包括以下步骤：

A1、对基板表面进行活化和修饰，使基板表面带有反应活性官能团；

A2、采用水溶性双功能连接单元将测序引物与修饰后的基板表面连接；

A3、采用水溶性双功能连接单元将定位用荧光标记物与修饰后的基板表面连接。

2.根据权利要求1所述的单分子测序芯片，其特征在于，所述的荧光量子点表面带有能与基板表面的基团或物质相互反应或者以非共价键结合的官能团；所述荧光微球为直径20-100nm的聚苯乙烯荧光微球，聚苯乙烯荧光微球表面带有能与基板表面的基团或物质相互反应或者以非共价键结合的官能团。

3.根据权利要求1所述的单分子测序芯片，其特征在于，所述流道的中部为长方体型，两端部为锥型，两端部分别设置第一流体入口和第一流体出口；

所述盖板上与第一流体入口和第一流体出口相应的位置分别设置有第二流体入口和第二流体出口，所述第一流体入口与第二流体入口连通，第二流体出口与第二流体出口连通；

所述的流道数量为2-16个，各所述流道宽度为2-8mm，长度为5-10cm，相邻流道的间距为2-5mm。

4.根据权利要求1所述的单分子测序芯片，其特征在于，所述基板的厚度为500-1000μm，所述盖板的厚度为100-500μm；

所述流道板的材质为硅片、玻璃或陶瓷中的一种；所述基板和盖板的材质为石英玻片或高硼硅玻片。

5.根据权利要求1所述的单分子测序芯片，其特征在于，所述流道采用光刻法制备，具体包括以下步骤：

S1、根据流道图样将光刻胶均匀涂覆于流道板表面，形成掩膜；

S2、采用紫外光照射覆盖了掩膜的流道板，然后去除掩膜，进行热处理；

S3、将热处理后的流道板冷却至室温后，进行刻蚀，然后清洗残留物，即形成流道。

6.一种根据权利要求1所述的单分子测序芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将流道板、基板和盖板进行清洗后，采用胶粘剂将其按顺序压合组装，即得所述单分子测序芯片。

7.一种采用权利要求1所述的芯片进行单分子测序的方法，其特征在于，包括以下步骤：

B1、通过第二流体入口将待测模板溶液加入流道中，与固定在基板表面的引物在65℃下温育5分钟进行杂交，通过第二流体出口将基板表面残留的液体抽出；

B2、通过第二流体入口将荧光素标记的不同碱基的可逆终止核苷酸、聚合酶、缓冲液的混合物加入流道中，在聚合酶的作用下进行延伸反应，时间为15分钟，温度为37℃；

B3、延伸反应结束后，从第二流体入口注入缓冲液清洗流道，从第二流体出口抽出清洗后残留的液体；

B4、使用合适波长的激发光照射标记在基板表面的定位用荧光标记物、对参与延伸的引物/模板复合物进行荧光定位，然后再用其他波长的激发光照射参与延伸之后的引物/模板复合物，通过参与延伸产物的荧光信号可识别相应的待测碱基；

B5、在流道底部的基板表面滴加断裂试剂溶液，在37℃下反应5分钟，再滴加保护剂溶液继续反应3分钟，从第二流体入口注入缓冲液清洗流道，从第二流体出口抽出清洗后残留的液体；

B6、重复以上步骤，可完成对待测模板的序列测定。