[发明专利]一种适用于免疫荧光分析的小麦根部细胞核提取方法

说明书

本发明公开了一种适用于免疫荧光分析的小麦根部细胞核提取方法，其步骤为：（1）小麦幼根的获取，（2）细胞核提取，（3）DAPI荧光染色法检测细胞核，（4）免疫荧光组织化学分析，（5）统计分析，本发明提供的细胞核提取方法可大大减少细胞核提取所需时间，延长细胞核内蛋白活性的保持，增加后续目的蛋白检测的准确性和成功率，降低细胞核悬液中杂质的浓度，减少杂质对免疫荧光实验的影响，增加细胞核悬液中细胞核的数量，便于后续进行相关的统计实验与分析。本发明提供的提取方法适用于制作细胞核悬浮液以便于进行后续的亚显微水平细胞学相关实验。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种适用于免疫荧光分析的小麦根部细胞核提取方法，该方法适用于制作细胞核悬浮液以便于进行接下来的亚显微水平细胞学相关实验。

背景技术

免疫荧光技术(immunofluorescence)是根据抗原抗体识别反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内相应的抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜就可以观察具有荧光标记的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，或者利用相关定量技术进行定量的研究【SAINTE MARIE G.A Paraffin-EmbeddingTechnique for Studies Employing Immunofluorescence[J].Journal ofHistochemistryCytochemistry,1962,10(3):250-256】，也被称为免疫组织化学。

目前，应用于植物免疫组织化学的实验对象主要为组织标本，主要包括石蜡切片和冰冻切片，其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存良好，还能长期存档，提供回顾性研究。但是，如果针对细胞核进行研究，特别是表观遗传学中对核内组蛋白的一些修饰进行研究，则组织切片就不是特别合适。首先，细胞核相对于植物组织而言，只是组织细胞中的一部分，但却是至关重要的。在常规组织切片中细胞核相对于整个切片而言个体较小，如果免疫荧光技术应用于细胞核内一些蛋白则不容易观察。其次，石蜡切片制样周期较长，过程繁琐，由于石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将围定时分子之间所形成的交联破坏，从而恢复抗原的原有空间形态【杨捷频,常规石蜡切片方法的改良[J].生物学杂志,2006,23(1):45-46；黄华伟,杜美菊.免疫荧光分析的研究进展[J].应用化工,2007,36(4):394-397】时，冰冻切片容易使植物组织本身造成冰冻伤害，只适用于一些特定的研究【Tokuyasu K T.Immunochemistry on ultrathin frozen sections[J].HistochemicalJournal,1980,12(4):381-403】。因此，目前关于将免疫荧光技术应用于细胞核内蛋白的方法，主要是将植物组织的细胞核提取出来制成细胞核悬浮液，再进一步制成细胞核贴片，进而完成相关免疫组织化学的实验【Grumin A A.Use of immunofluorescence method forstudies of plant nuclei[J].Biulleten,1977；Beven A F,Simpson G G,Brown J W,etal.The organization of spliceosomal components in the nuclei of higher plants[J].Journal of Cell Science,1995,108:509；Bai X D,Correa V R,T Y,etal.AY-WB phytoplasma secretes a protein that targets plant cell nuclei[J].MolPlant Microbe Interact.2009,22(1):18-30】。