[发明专利]一种适用于免疫荧光分析的小麦根部细胞核提取方法

权利要求书

1.一种适用于免疫荧光分析的小麦根部细胞核提取方法，其步骤为：

（1）小麦幼根的获取：

将小麦种子消毒冲洗后在20-25℃置于放有湿润滤纸的培养皿中避光发芽，出芽1天后将幼苗移至培养间生长，生长期间补浇2次营养液，待幼苗生长至第5天，取小麦幼根备用，

所述的幼苗在培养间的培养条件为：18-23℃，65-75%相对湿度、光照12-14h/d；

所述的营养液为1/2霍格兰氏营养液，其配方为：2mM硝酸钙，2.5mM硝酸钾，0.5mM硝酸铵，0.5mM磷酸二氢钾，1mM硫酸镁，2.5μM碘化钾，50.2μM硼酸，50μM硫酸锰，15μM硫酸锌，0.52μM钼酸钠，0.05μM硫酸铜，0.053μM氯化钴，25μM乙二胺四乙酸一钠铁，每次添加20-30mL；

（2）细胞核提取：

取步骤（1）获得的小麦幼根0.5g，将材料截取成4-6mm的根段，置于冰上培养皿中，加入1mLMgSO₄缓冲液，用双面刀片将材料在溶液中切成小碎块，使根细胞的细胞核在提取液中流出即可，之后通过过滤器将培养皿中的溶液转移至离心管中，4℃1500r/min离心8-12min，弃上清，沉淀加MgSO₄缓冲液重悬，即得细胞核悬液；

步骤（2）中所述的MgSO₄缓冲液的组分为：10mmol/L硫酸镁，50mmol/L氯化钾，5mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸，3mmol/L二硫苏糖醇，体积比为0.25% TritonX-100，pH值7.4-7.6，现配现用；

步骤（2）中所述的过滤器由450目尼龙膜和灭菌后的1.5 mL离心管组成，其制作方法为将尼龙膜裁剪成直径2cm的圆片后，折成漏洞状直接放入离心管中，三层滤膜处靠管壁；

（3）DAPI荧光染色法检测细胞核：

取20μL步骤（2）所制得的细胞核悬液，滴于附有多聚赖氨酸的载玻片上，制成细胞核贴片，室温晾干后，在避光条件下，载玻片上滴20μL的DAPI染液染色4-6min，去除染液后，用0.01mM，pH7.2的PBS清洗5次，盖上盖玻片，直接置于荧光显微镜下观察并拍照；

（4）免疫荧光组织化学分析：

取出制好的细胞核贴片，在玻片上加50μL质量体积比为3%的BSA溶液，盖上盖玻片，于37℃ 封闭1 h；揭去盖玻片，用0.01mM，pH7.2的PBS溶液清洗3次，每次4-6min；在玻片上加入50μL—抗，盖上盖玻片，于4℃孵育12h；揭去盖玻片，用0.01mM，pH7.2的PBS溶液清洗3次，每次4-6min；避光条件下，在玻片上加50μL带有FITC标记的二抗，盖上盖玻片，于37℃孵育1h；揭去盖玻片，用0.01mM，pH 7.2的PBS溶液清洗3次，每次4-6 min；之后再进行 DAPI染色，荧光显微镜下检测信号，并拍照记录结果；

（5）统计分析：

选取5张图片，实验重复3次；细胞核直径、数量的数据统计利用软件Image J，3次测量取平均值；相关统计数据利用GraphPad Prism 7.00进行双尾T检验分析，P0.05说明存在显著性差异。