[发明专利]一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法

说明书

本发明涉及一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，属于临床体外检测技术领域，其基本步骤为首先配置缓冲液，然后加入对氨基苯磺酸和AEO‑9两种物质作为激活剂，然后加入载体PEG20000（sigma），再加入保护剂以及乳化剂和离子物质搅拌均匀后，依次加入胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，慢中速搅拌10分钟，然后使用低转速离心机离心后，取出上清液即可得到同等效果的PEG修饰酶。配方组成成分：PIEPES、对氨基苯磺酸、AEO‑9、PEG20000、保护剂、乳化剂、离子物质、胆固醇氧化酶、胆固醇脂酶、MIT，本方法操作简单、成本低，与PEG修饰酶法检测高密度脂蛋白胆固醇具有良好的兼容性。

技术领域

本发明涉及一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法，属于临床体外检测技术领域。

背景技术

PEG修饰酶法检测血清高密度脂蛋白胆固醇，由1995年Sugiuchi首先提出，属于均相法检测血高密度脂蛋白胆固醇的一种重要的方法，其方法的反应原理为试剂1中硫酸α-环糊精 、硫酸葡聚糖与标本中的LDL、VLDL及CM形成水溶性复合物。试剂 2 中PEG修饰酶系对 HDL发生反应，从而达到检测目的。本法原理着重点在于:①硫酸α-环糊精对富含apoB的LDL组分产生一种屏蔽作用；②PEG修饰酶中的PEG分子产生空间位阻,不利于大分子底物与酶接触,而又不影响小分子的HDL与酶发生酶促反应；③试剂2中的表面活性剂在不影响硫酸α-环糊精-LDL复合物的基础上能使HDL快速充分溶解。上述三点充分保证HDL 测定的特异性和准确性。本法试剂非常优良，与CDC指定的比较方法具有非常好的相关性，本法能够实现对HDL充分、快速反应 ,对LDL的非特异性反应极少，抗干扰能力较强，结果较准确。

但因技术难度较大 ,国内尚无产品问世 ，技术问题主要存在于修饰酶的合成与表面活性剂的筛选，其中最难以控制的就是PEG修饰酶的制备，Sugiuchi建立的方法为首先将PEG6000使用N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺（DCCI）进行活化，将胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，加入到0.1mol/L的HEPES PH=8.5的缓冲液，溶解完全后，将活化的PEG6000加入到酶溶液中，令PEG6000与酶通过共价键结合在一起 ，至少需要30分钟的时间，然后将PEG6000使用滤网将其过滤掉，然后使用HPLC方法进行检测结合后的酶的活性，作者通过大量的实验发现，本方法存在以下几个问题：①在PEG6000与酶结合的过程中，即使是PEG6000非常过量，但是也有少量的酶类没有被结合，这就在使用的时候为修饰酶的特异性增加了难度；②所激活PEG6000的两种物质，如果清理不当，会对后面HDL-C的检测造成影响，③如果没有结合酶的PEG过滤不够彻底，则会造成结果HDL-C的检测不准确，④修饰酶的过程过于繁杂，需要很高的技术和实验水平，修饰酶的获取成本高。

因此基于以上的条件制约，影响了PEG-修饰酶法这种非常优良的检测方法的普及和推广，因此根据这些问题，发明了一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法。

发明内容

本发明涉及一种PEG修饰胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶的制备方法。

本发明是通过以下步骤得到的：

1）基本原理：以PEG20000为载体，在激活剂以及离子物质存在的情况下，使胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶与PEG20000之间形成离子键，以获取具有对脂蛋白具有选择性的PEG修饰酶；

2)基本步骤：

首先配置缓冲液，然后加入对氨基苯磺酸和AEO-9两种物质作为激活剂，然后加入载体PEG20000（sigma），再加入保护剂以及乳化剂和离子物质搅拌均匀后，依次加入胆固醇氧化酶和胆固醇脂酶，慢中速搅拌10分钟，然后使用低转速离心机离心后，取出上清液即可得到同等效果的PEG修饰酶；

3)配方组成成分：