[发明专利]构建B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法

说明书

本发明公开了一种构建B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法。该方法包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9技术在目的小鼠的基因组中B2m基因的起始密码子处定点敲入缺失起始密码子ATG的人源B2M cDNA。将Cas9mRNA、gRNA和同源重组载体(包含2kb 5’同源臂、Human B2M cDNA‑3×polyA和2kb 3’同源臂)显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，进而获得相应的小鼠模型。人源B2M cDNA小鼠对HSV‑1病毒或其它疱疹类DNA病毒易感，可用作动物模型筛查抗病毒药物或研究病毒与宿主相互作用的机理。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种构建B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法。

背景技术

人的B2M的RNA转录本与鼠的不同，能促进HSV-1病毒的繁殖，因而人源B2M cDNA小鼠对HSV-1病毒或其它疱疹类DNA病毒易感，可用作动物模型筛查抗病毒药物或研究病毒与宿主相互作用的机理。

CRISPR-Cas9本是细菌用于对抗入侵的病毒及外源DNA一种适应性免疫防御机制，经科研人员的努力目前已发展成为最有力的基因编辑技术。目前，来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。由于PAM序列结构简单(5’-NGG-3’)，几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。

发明内容

本发明的目的是提供一种构建B2m定点敲入人源B2M cDNA的小鼠模型的方法。

本发明所提供的构建B2m定点敲入人源B2M cDNA的小鼠模型的方法，包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9技术在目的小鼠的基因组中B2m基因的起始密码子处定点敲入缺失起始密码子ATG的人源B2M cDNA。缺失了ATG才能只表达人源B2M mRNA，但不会转录出B2M蛋白，以非编码核酸的形式发挥作用。

在本发明的一个实施例中，具体是利用CRISPR/Cas9技术将目的小鼠的基因组中自B2m基因的起始密码子起向3’端延伸包括B2m基因的起始密码子在内共计13个核苷酸替换为缺失起始密码子ATG的人源B2M cDNA及3xpolyA片段。只要是在目的小鼠的基因组中B2m基因的起始密码子处定点敲入缺失起始密码子ATG的人源B2M cDNA理论上即可实现发明目的，ATG的缺失确保转录出的人源B2M以非编码RNA的形式起作用，而3xpolyA片段的加入，使跟在人源B2M cDNA后面的鼠的B2m基因不会转录。

在所述方法中，作为被Cas9核酸酶切割的靶序列是所述目的小鼠的基因组中B2m基因中符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列规则的片段；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数(如X＝23)，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。

进一步地，所述靶序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2。

在所述方法中，作为定点敲入工具的同源重组载体上含有如下DNA片段A；所述DNA片段A自上游到下游依次包含5’同源臂、缺失起始密码子ATG的人源B2M cDNA、3个连续的polyA(3xpolyA片段)、3’同源臂；所述5’同源臂为位于所述目的小鼠的基因组中B2m基因的起始密码子上游的2kb序列；所述3’同源臂为位于所述目的小鼠的基因组中B2m基因的起始密码子下游的2kb序列。