[发明专利]构建B2m定点敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法

权利要求书

1.一种构建B2m定点敲入人源B2M cDNA的小鼠模型的方法，包括如下步骤：利用CRISPR/Cas9技术在目的小鼠的基因组中B2m基因的起始密码子处定点敲入缺失起始密码子ATG的人源B2M cDNA；

在所述方法中，作为定点敲入工具的同源重组载体上含有如下DNA片段A；所述DNA片段A自上游到下游依次包含5’同源臂、缺失起始密码子ATG的人源B2M cDNA、3个连续的polyA、3’同源臂；所述5’同源臂为位于所述目的小鼠的基因组中B2m基因的起始密码子上游的2kb序列；所述3’同源臂为位于所述目的小鼠的基因组中B2m基因的起始密码子下游的2kb序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述方法中，作为被Cas9核酸酶切割的靶序列是所述目的小鼠的基因组中B2m基因中符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列规则的片段；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数，N_X表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述靶序列为SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述5’同源臂的序列为SEQ ID No.3的第1-2000位；所述缺失起始密码子ATG的人源B2M cDNA的序列为SEQ ID No.3的第2001-2984位；所述3个连续的polyA的序列为SEQ ID No.3的第3008-3758位；所述3’同源臂的序列为SEQ ID No.3的第3781-5780位。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述DNA片段A的序列为SEQ ID No.3。

6.根据权利要求1-5中任一所述方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

(1)将Cas9 mRNA、gRNA和权利要求1-5任一中所述的同源重组载体注射到所述目的小鼠的受精卵胞质中，得到F0代小鼠；

所述gRNA的序列为将SEQ ID No.1或SEQ ID No.2中的T替换为U后得到的序列；

(2)将步骤(1)获得的所述F0代小鼠与所述目的小鼠进行杂交，从F1代小鼠中获得B2m定点敲入人源B2M cDNA的杂合体小鼠。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于：在步骤(2)之后，还包括如下步骤：将雄性的所述杂合体小鼠与雌性的所述杂合体小鼠进行一次或多次杂交，从杂交后代中获得B2m定点敲入人源B2M cDNA的纯合体小鼠。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述Cas9 mRNA的序列为SEQ ID No.4。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述同源重组载体为将SEQ ID No.3所示DNA片段插入到NM-322载体的第702位和第703位之间后得到的重组质粒；所述NM-322载体的全序列为SEQ ID No.5。

10.用于构建B2m定点敲入人源B2M cDNA小鼠模型的试剂盒，包括权利要求6或8中所述的Cas9 mRNA、权利要求6中所述的gRNA和权利要求6或9中所述的同源重组载体。

11.由权利要求1-9中任一所述方法构建得到的小鼠模型在筛查抗病毒药物或研究病毒与宿主相互作用的机理中的应用。

12.由权利要求1-9中任一所述方法构建得到的小鼠模型在作为筛查抗病毒药物或研究病毒与宿主相互作用的机理的动物模型中的应用。