[发明专利]一种玉米大斑病高效抗病鉴定接种体及其制备方法

权利要求书

1.一种玉米大斑病高效抗病鉴定接种体，其特征在于：接种体由以下重量比的原料组成：小麦100g、甘露醇2.0～3.0g、玉米叶10～25g。

2.根据权利要求1所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1）玉米大斑病强致病力菌株的筛选，先进行病菌的分离，然后用单细胞进行纯化，采用柯赫氏法则进行病菌的验证，最后通过常规菌株致病力的测定筛选出强致病力菌株；

2）玉米大斑病强致病力菌株的保存，把筛选到的强致病力菌株放入PCA斜面培养基中培养4～7d，放入4℃冰箱进行保存；

3）二级菌种的配制：活化后的菌株放入灭菌后的高粱粒培养基中在24～26℃培养6～7d，即得二级菌种；

4）接种体的配制，按配方配制原料，把所需原料混匀，湿度以药品能溶解、玉米叶能掺和在籽粒上而无滴水为度，配好的培养基装入三角瓶中，以不超过培养瓶二分之一的空间为度，套上三角瓶塞，瓶塞外盖一层牛皮纸，用胶卷固定，经过121帕高压灭菌45～100min备用；

5）接种体的培养：把在高粱粒上培养的二级菌种混入接种体上，每100g接种体接种5～10g二级菌种，在20℃条件下光暗交替各12 h、光照强度为2000lx条件下对其进行培养7～8d，菌丝长满接种体后在无菌操作条件下用木棒把带菌丝的培养基进行充分搅拌，把三角瓶内塞去掉，留下牛皮纸继续把瓶口封住，菌瓶放在原培养箱继续培养6～8d即可得到玉米大斑病高效抗病鉴定接种体。

3.根据权利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法，其特征在于：所述步骤1）单细胞纯化的方法采用标记法单细胞纯化，具体步骤为：在培养皿中倒入10ml薄层PDA培养基，把稀释好的孢子悬浮液布满在培养基上，孢子悬浮液在100倍镜下每视野1～2个孢子的浓度，用封口薄膜把培养皿套口封上，移入26～30℃的培养箱进行培养8～10h；用低倍镜从培养皿反面检查，挑选在视野内只有1个已经萌发的孢子，且其附近没有其它孢子或菌丝存在，用记号笔对着孢子存在的位置在培养皿反面画上一个小点作记号，培养皿继续放在24～26℃的培养箱进行培养3～5d，标记处的孢子长出的菌落即为该病菌的单细胞菌落。

4.根据权利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法，其特征在于：所述步骤2）中，PCA培养基的配方为：马铃薯20g、胡萝卜20g、琼胶16～20g、水1000ml。

5.根据权利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法，其特征在于：所述步骤4）按配方配制原料前，对原料小麦、玉米叶进行处理，处理方法为：挑选籽粒饱满、大小一致、无病虫的带皮小麦粒清水浸泡18～25min，水煮15～20min，水洗沥干备用；玉米叶用刚从大田采集的新鲜玉米叶切成约1cm²的碎片备用。

6.根据权利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法制备得到的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体在玉米抗病性鉴定中的应用，其特征在于：采用带菌接种体接种法，所述具体步骤为：在玉米10～13叶时，把培养好的接种体接种于玉米心叶内，每株接种2～4g菌粒，接种后田间保湿7d，在玉米乳熟期调查玉米叶片发病情况，评价玉米对该病菌的抗病情况。

7.根据权利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法制备得到的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体在玉米抗病性鉴定中的应用，其特征在于：采用菌液灌心接种法，所述具体步骤为：把培养好的接种体用加有Tween-20的2%蔗糖溶液洗涤，Tween-20的浓度为0.01%，制成浓度为3×10⁷个孢子/mL 的分生孢子悬浮液，在玉米第10～13叶时用移液枪将菌悬液接种至玉米心叶内，3mL/株，接种前先进行田间浇灌，接种后连续3d早晚对叶面喷水保湿，在玉米乳熟期调查玉米叶片发病情况，评价玉米对该病菌的抗病情况。

8.根据权利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体的制备方法制备得到的玉米大斑病高效抗病鉴定接种体在玉米抗病性鉴定中的应用，其特征在于：采用孢子悬浮液喷雾法，所述具体步骤为：把培养好的接种体加水淘洗，纱布过滤，加0.01% 吐温(v/v)配制成孢子悬浮液，悬浮液中分生孢子浓度调至1×10⁵～3×10⁵个孢子/mL，在玉米第10～13叶时将孢子悬浮液对玉米植株进行喷雾接种，每株喷雾7～10ml菌液，接种前先进行田间浇灌，接种后连续3d早晚对叶面喷水保湿，在玉米乳熟期调查玉米叶片发病情况，评价玉米对该病菌的抗病情况。