[发明专利]一种重组表达载体及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种高表达的重组蛋白载体pRELPN，是由9聚精氨酸(R9)‑类弹性蛋白多肽(ELP)n‑10聚天冬酰胺(N10)组成的人工合成的ELP融合蛋白(RELPN)，当克隆在原核或真核表达载体(p)的多克隆位点不是作为外源基因直接表达，而是作为起第二启动子的作用。pRELPN载体促进克隆在ELP融合蛋白后起始密码ATG后的外源目的基因独立高表达，该融合蛋白本身极少表达，并且轻微抑制大肠杆菌或真核细胞等宿主自身蛋白的表达，促进外源目的基因的重组蛋白积聚和高表达，这类含双启动子的高表达载体pRELPN适合于表达包括抗体、抗原、酶、重组蛋白、多肽、及ELP融合蛋白等的外源基因的独立高表达，从而有助于解决普通表达载体对外源基因或外源基因与ELP组成的融合基因的低表达或不表达导致不能产业化的问题。

技术领域

本申请属于基因工程技术领域，涉及一种高表达的重组表达载体pRELPN及其构建方法和应用。

背景技术

自从1909年丹麦遗传学家约翰逊(W.Johansen 1859～1927)在《精密遗传学原理》一书中正式提出“基因”概念后，20世纪50年代以后，随着分子遗传学的发展，尤其是沃森和克里克提出DNA双螺旋结构以后，人们用各种办法采用各种表达载体在细菌(大肠杆菌)、酵母、植物、昆虫及细胞系中表达各种生物或人的基因，以研究基因的功能和促进基因产业重组蛋白的产业化应用。目前人类相关蛋白有75％可以在大肠杆菌中表达，许多蛋白已经在药物治疗中发挥了巨大作用，例如1982年用于糖尿病治疗的人胰岛素得到批准生产。但是，目前仍有许多基因在上述各类表达系统中低表达或不表达导致无法产业化应用或无法研究其功能。

类弹性蛋白多肽(elastin-like polypeptides,ELP)是一种人工合成的基因工程化多肽聚合物，有多种不同的形式，主要是(VPGXG)n五肽重复序列，也有一些变异形式，例如，(KGGVG)n,(VGGVG)n,(GVGVP)n,(LGAGGAG)n,(LGAGGAGVL)n等,人的ELP为(VAPGVG)n。目前ELP研究最多的最主要的形式由Val-Pro-Gly-Xaa-Gly(VPGXG)n五肽重复单元串联组成，其中Xaa(X)指除了脯氨酸(Pro)外的氨基酸，通常为缬氨酸(Val，V),丙氨酸(Ala,A),甘氨酸(Gly,G)亮氨酸(Leu,L)异亮氨酸(Ile,I)，赖氨酸(Lys,K),苯丙氨酸(Phe,F),组氨酸(His,H)等几种氨基酸类型，重复单元n通常为20-120不等。Xaa(X)可以是在重复单元n为20-120中由除了Pro外的单一氨基酸组成，也可以例如上述Val,Ala,Gly,Ile,Leu，Lys,Phe,His等氨基酸以不同比例组成，但是VPGXG中前3个和最后1个氨基酸在五肽重复单元中一直保持不变,只变化第4个氨基酸的类型或比例,重复单元n通常为20-120不等。ELP蛋白单独或与外源基因在N端或C端形成融合蛋白表达时具有相转变特性，即达到一定温度时ELP蛋白或ELP融合蛋白能发生从溶液到凝聚态的可逆转变，随着温度降低到一定温度，则又能恢复溶液态，当Xaa为疏水性基团时，相变温度可降低，反之则升高，因此可以根据Xaa极性不同设计出不同的相变温度的ELP或ELP融合蛋白，从而通过ELP凝聚态的可逆转变，利用离心就能分离重组蛋白，达到重组蛋白的简单的ITC(inverse transition cycling)非色谱纯化(Rodriguez-Cabelo JC,Arias FJ,Rodrigo MA.et al.Elastin-likepolypeptides in drug delivery.Advanced Drug Delivery Reviews.2016,97:85-100)。此外，ELP已被证明能增强植物中不同的重组蛋白的积累，ELP在植物内质网中增加重组蛋白积累，从而解决了植物源表达系统产量低的主要局限性(Conley AJ,Joensuu JJ,Menassa R.et al.Induction of protein body formation in plant leaves byelastin-like polypeptide fusions.BMC Biology.2009,7(48):1-18)。