[发明专利]一种重组表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种ELP融合蛋白RELPN，其特征在于，所述ELP融合蛋白RELPN由9聚精氨酸(R9)-类弹性蛋白多肽(ELP)m-10聚天冬酰胺（N10）组成，所述9聚精氨酸(R9)在ELP融合蛋白RELPN的N端，10聚天冬酰胺（N10）在ELP融合蛋白RELPN的C端；

所述类弹性蛋白多肽(ELP)m由串联的五肽重复单元（VPGXG）n通过酶切位点间隔连接或克隆形成；

所述串联的五肽重复单元（VPGXG）n中，（VPGXG）为Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，所述Xaa（X）为除脯氨酸外的任何氨基酸；每个（VPGXG）五肽重复单元的串联个数n为20-120；

所述串联的五肽重复单元（VPGXG）n为ELP[V10G6A4]20（SEQ ID NO.1）、ELP[V20]20（SEQ ID NO.2）、ELP[K2V16F2]20（SEQ ID NO.3）、ELP[I20]20（SEQ ID NO.4）、ELP[A20]20（SEQ ID NO.5）中的一种；

类弹性蛋白多肽(ELP)m为ELP[V30G18A12]60、ELP[V60]60、ELP[K6V48F6]60、ELP[I60]60、ELP[A120]120中的一种。

2.一种重组载体pRELPN，其特征在于，所述重组载体pRELPN为将权利要求1所述ELP融合蛋白RELPN克隆入原核或真核载体（p）的多克隆位点得到；

ELP融合蛋白RELPN插入在前后两个起始密码ATG之间；

所述原核载体为pET28a,pET26b, pET30a或pPICZαA中的一种；所述真核为pIRES2-EGFP；

所述ELP融合蛋白RELPN插入在pET28a的多克隆位点NcoI和NdeI之间，或pET26b、pET30a的多克隆位点NdeI和NcoI之间，或pPICZαA的多克隆位点EcoRI和KpnI之间，或真核表达载体的多克隆位点NheI和XhoI之间。

3.权利要求2所述的重组载体pRELPN的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：人工合成串联的五肽重复单元（VPGXG）n；

S2：将S1合成的串联的五肽重复单元（VPGXG）n通过连接结构间隔连接，或通过两端加上酶切位点克隆，得到类弹性蛋白多肽(ELP)m；所述连接结构为多克隆位点内的酶切位点；

S3：在S2得到的类弹性蛋白多肽(ELP)m的N端前加上9聚精氨酸(R9)，C端后加上10聚天冬酰胺（N10），得到ELP融合蛋白RELPN；

S4：将S3得到的ELP融合蛋白RELPN克隆到表达载体（p）的多克隆位点之间，得到重组载体pRELPN。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S2所述连接结构为酶切位点BamHI，EcoRI，HindIII中的一种或几种，克隆所用的酶切位点为pflMI（SEQ ID NO.10）和BglI（SEQ IDNO.11）。

5.一种重组表达载体pRELPN，其特征在于，在权利要求2所述重组载体pRELPN的ELP融合蛋白RELPN后的酶切位点之间插入外源目的基因。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体pRELPN，其特征在于，所述外源目的基因插入在pET28a的NdeI和 XhoI酶切位点之间，或pET26b、pET30a的NcoI和XhoI酶切位点之间，或pPICZαA的KpnI和NotI酶切位点之间，或pIRES2-EGFP的EGFP基因的酶切位点之间。

7.权利要求2所述的重组载体或权利要求5所述的重组表达载体pRELPN在促进外源目的基因的独立高表达中的应用，其特征在于，所述外源目的基因包括多肽或融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述多肽选自抗体、抗原、酶中的一种或多种，所述融合蛋白选自ELP融合蛋白。