[发明专利]启动子增强系统及其在细菌中的应用

说明书

本发明公开了启动子增强系统及其在细菌中的应用。本发明公开的启动子增强系统包括CERR蛋白质编码基因与PA启动子；CERR蛋白质为氨基酸序列为序列2的蛋白质；PA启动子为序列表中序列1的第256‑548位所示的DNA分子。实验证明，本发明的启动子增强系统在不同的G⁺及G^‑菌中，均可显著地提高下游蛋白的表达量，在乳杆菌中可以将蛋白的表达水平提高70多倍，因此该系统具有很好的应用潜力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，启动子增强系统及其在细菌中的应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、乳酸菌(Lactic Acid Bacterial)及大肠杆菌(Escherichia coli)是3种非常重要的原核表达宿主，是工业生产及医药领域主要的生产菌株，同时也是科学研究领域中重要的模式菌株，均具有很高的应用价值及研究价值。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)因培养简单快速，具有较强的分泌蛋白质的能力、非致病性(不含内毒素)及良好的发酵基础和生产技术，是目前生产各种工业用酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等的理想表达宿主。乳酸菌是重要的益生菌，因其被公认为是安全的(generally regarded as safe,GRAS)食品级微生物，且不产生内毒素，自身分泌性蛋白质较少，不产生细胞外蛋白酶，不会对目的分泌蛋白进行胞外降解，因此是很具吸引力的基因工程菌。应用乳酸菌基因表达系统产生的大量酶、多肽、中间代谢物等表达产物，可以应用于食品、医药、保健业和工业等领域，有巨大的应用前景和潜在的商业价值。大肠杆菌(Escherichia coli)是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，其遗传背景清楚、转化和转导效率高、培养操作简单、生长繁殖快、成本低廉，可快速大规模地生产目的蛋白，且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的30％，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。

鉴于以上3种表达宿主的优良性状及广泛用途，建立和发展相应的基因克隆和表达系统，实现有生产价值蛋白的高产，将取得巨大的科研价值与经济利益，实现外源蛋白高效表达的关键因素之一是使用强并可控制的启动子，启动子是基因表达调控的重要顺式调控元件，也是基因工程表达载体的重要元件。依照控制转录水平的高低，启动子可以分为强启动子和弱启动子；从转录模式上分类，启动子可以分为组成型启动子、诱导型启动子、时期特异性启动子及自诱导启动子。目前发现的强启动子多为组成型启动子，组成型启动子即不需要任何诱导物，持续性表达蛋白的启动子，可用作调控元件构建表达载体实现目标蛋白的胞内或胞外大量表达。

P43是革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌的组成型强启动子，但其启动下游基因转录的效率仍不高，虽然通过启动子诱捕系统(promoter trap system)等分子生物学手段发现了多种新型的启动子，如P_laps，是目前应用在枯草芽孢杆菌中表达的最强的组成型启动子，但此启动子的强度只是P43的13倍，应用于芽孢杆菌的强启动子系统仍有待进一步开发。乳酸菌外源蛋白表达量一般相对偏低，且乳酸菌宿主对表达载体的启动子要求比较严格，具有很高的特异性和选择性，目前可用于构建乳酸菌表达载体的启动子数量相对较少，其中大多数乳酸菌表达载体的启动子活性不高，且需要诱导，这不仅降低了外源蛋白表达的效率，也使操作变得繁琐，更重要的是限制了乳酸菌的实际应用。对于芽孢杆菌及乳酸菌，组成型启动子不需诱导等特殊条件即可在菌体存活期持续不断地表达外源基因，从而简化了操作过程、且具有相对较高的安全性，更适合在实际生产中应用，因此寻找组成型的强启动子对于芽孢杆菌及乳酸菌具有十分重要的意义。应用于大肠杆菌的启动子多为诱导型启动子，常用的T7启动子，需IPTG诱导，IPTG价格较高，在生产应用中会增加成本，而阿拉伯糖诱导的启动子，虽然成本较IPTG低，但是启动子强度也低于T7，因此如果能增强阿拉伯糖诱导的启动子，不仅降低了成本也达到了高产外源蛋白的目的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何提高外源基因在生物细胞中的表达量。