[发明专利]一种K-ras基因突变的快速检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种K‑ras基因突变的快速检测试剂盒，属于分子生物学技术领域。试剂盒包括用于检测10个敏感突变位点的ARMS上游引物、下游引物、触发引物、荧光探针。K‑ras基因检测试剂盒可以在单管条件下同时检测10个主要的突变，利用了触发引物的设计，当任意一种突变存在时，即可使反应体系出现荧光，实现了快速检测判定K‑ras突变的效果，该试剂盒具有检测速度快、灵敏度能够达到0.001%的优点。

技术领域

本发明涉及一种K-ras基因突变的快速检测试剂盒，属于分子生物学技术领域。

背景技术

KRAS是EGFR（表皮生长因子受体）信号传导通路中的一个关键的下游调节因子，参与细胞生长的调节，在癌变发生过程中起着重要作用。KRAS基因产物参与了控制基因转录的激酶信号传导路径，从而能调节细胞的生长与分化。KRAS基因的改变使KRAS蛋白发生变化，其结果KRAS蛋白不再具有裂解GTP分子和释放GTP分子的能力。这样的改变导致这条信号传导路径始终处于“开”通的状态。这种“开”的信号导致细胞的生长和增生。因此KRAS的过度表达与扩增导致持续的细胞增殖，这是肿瘤发生的关键一步。

原发性肺癌（以下简称肺癌）是我国最常见的恶性肿瘤之一。2012年WHO统计显示，肺癌是我国目前发病率和死亡率第1位的恶性肿瘤。基于肺癌的生物学特性、治疗和预后，WHO将其分为两大类：非小细胞肺癌NSCLC和小细胞肺癌SCLC。其中NSCLC占肺癌的85%以上。虽然治疗肺癌技术有了很大的提高，但5年生存率没有明显改善，而且大多数肺癌患者死于无法控制的远处转移，传统的化疗和放疗由于缺乏特异性，取得疗效的同时也往往给患者带来较大的副作用。因此，选择肺癌细胞特异的分子靶点，应用针对该靶点的药物进行治疗，在取得明显疗效的同时又避免对正常细胞的伤害的治疗模式，已经被肿瘤学术界和广大患者所认同和采用。

三种EGFR-TKI（吉非替尼/易瑞沙，厄罗替尼/特罗凯，和凯美钠）是目前用于NSCLC分子靶向治疗的主要药物，但在不同的病人中EGFR-TKI的疗效差异很大。大量临床实验发现，除了EGFR突变，KRAS突变能帮助NSCLC病人更好的预测吉非替尼疗效；KRAS突变的NSCLC病人用厄洛替尼联合处理后临床预后较差。

2012年《美国国立癌症综合网络(NCCN)非小细胞肺癌临床实践指南》病理评估原则中明确：KRAS突变和内源性TKI耐药有关，确定KRAS基因状态有助于选择适合TKI治疗的病人。同时指出，KRAS基因状态是NSCLC生存的预后指标，也是EGFR-TKI药物的疗效预测指标；还和顺铂/长春瑞滨化疗疗效相关。

K-ras基因是RAS基因家族中的一种，定位在人类的12号染色体上，是一种原癌基因，对人类癌症影响很大。K-ras基因编码分子量为21kD的ras蛋白又名p21蛋白，p21蛋白位于细胞膜的内表面，具有GTP酶活性，参与细胞内的信号传导，结合GTP时为活化态，结合GDP时为失活态。K-ras基因在机体内好像分子开关，它在肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的信号传导通路中起着重要调控作用，正常的K-ras基因可抑制肿瘤细胞生长，但发生异常时会诱导基因永久活化，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。K-ras基因被激活的方式有3种：基因点突变、基因大量表达、基因插入及转位。其中点突变最常见，多发生在2号外显子的12号密码子和13号密码子上，密码子61、63、117、119和146较少见。