[发明专利]一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片制备方法和检测方法

说明书

本发明提供一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的制备方法，优化PPV VP2密码子，克隆至pColdI后，转化至大肠杆菌Rossetta 2，进行PPV VP2蛋白的表达。成功表达的VP2蛋白用镍磁珠纯化。将纯化后的PPV VP2蛋白点样到环氧基片，于37℃干燥过夜。次日将芯片表面贴上芯片围栏，每个围栏封闭、洗涤即得。检测时，将封闭后的芯片加入PPV抗体阳性猪血清，洗涤、干燥，加入兔抗猪金标二抗孵育、洗涤、干燥，每个围栏加入银染显色液显色，洗涤后干燥观察结果。本发明提供的检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片可用于实验室检测，也可满足基层养殖场，能够更快速、方便、高通量地检测猪细小病毒抗体的蛋白芯片诊断技术，及时监测猪群细小病毒抗体水平。

技术领域

本发明涉及一种生物芯片，尤其涉及一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的制备方法和检测方法。

背景技术

猪细小病毒病(porcine parvovirus infection，PPI)是由猪细小病毒((porcineparvovirus，PPV) 感染所引起的一种猪繁殖障碍病，该病主要表现为：受感染的母猪，特别是初产母猪发生死胎、畸形胎和木乃伊胎及弱仔等，但母猪本身无明显的症状。该病广泛存在于世界各地，严重影响养猪业的发展。

猪细小病毒感染可以依据临诊症状和流行病学做出初步诊断，一般认为，如果仅妊娠母猪发生流产、死胎、木乃伊胎、胎儿发育异常等繁殖障碍症状，同时有证据表明是传染性疾病时，应考虑到猪细小病毒感染的可能，但是进一步确诊必须进行实验室诊断。自从首次报道猪细小病毒病以来，国内外学者对该病的诊断方法进行了大量研究，但是各种诊断方法各有利弊。

常用于猪细小病毒病诊断的实验室诊断方法有PCR、RT-PCR、QPCR、病毒中和试验、免疫荧光技术、乳胶凝集试验、免疫组化试验、免疫胶体金技术、DNA探针、纳米探针技术等。其中，间接ELISA检测猪细小病毒抗体，是目前临床上常用的一种方法，有市售猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒，也可由实验室自行纯化蛋白并包被至96孔板，建立ELISA检测技术。范朋举等报道中记载，具体为利用大肠杆菌原核表达系统表达猪细小病毒VP2蛋白，经镍柱纯化得到VP2蛋白。将纯化后的VP2蛋白以2-10μg/mL的浓度包被至96孔板，加入100μL100倍稀释的待检血清37℃孵育1h,100μLHRP标记的抗体37℃孵育1h，加100μLTMB底物37℃显色15min，立即用50μL2mol/LH2SO4终止反应。该方法的判定标准为：抗体效价若大于0.18确定为猪细小病毒抗体阳性。

但是，ELISA灵敏性相对较低；每个待检样需要200-1000ng蛋白，需要较大量的VP2蛋白；待检血清采集耗费工作量；结果判定需要特定的仪器。

蛋白芯片检测技术是近年来在生物科技领域发展起来的一项针对蛋白及多肽等高分子生物的检测技术。作为一种快速、简便、高通量生物芯片分析检测技术，近年来在食品检验、蛋白质组学、疾病诊断、药物筛选、农林畜牧业以及司法鉴定等领域应用日渐增多。蛋白芯片是将各种蛋白质(如抗原、抗体)、多肽以及受体、配体等有序固定于某一载体(如滤膜、凝胶、玻片、纳米微珠和微孔板)之上，以分析检测样品中能与之特异相互作用的成分。但是，生物芯片应用于动物疫病诊断的研究并不广泛。

因此，急需建立一种可用于实验室检测，也可满足基层养殖场，用于更快速、方便、高通量地检测猪细小病毒抗体的蛋白芯片诊断技术，及时监测猪群细小病毒抗体水平。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的制备方法和检测方法。

一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

S1：优化PPV VP2密码子，合成优化的猪细小病毒PPV VP2基因(SEQ ID No.1)；