[发明专利]一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片制备方法和检测方法

权利要求书

1.一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

S1：优化PPV VP2密码子，合成优化的猪细小病毒PPV VP2基因(SEQ ID No.1)；

S2：将S1制得的猪细小病毒PPV VP2基因克隆至载体pColdI，得到酶切和测序鉴定正确的阳性克隆pColdI-VP2；

S3：将S2制得的阳性克隆pColdI-VP2转化至大肠杆菌Rossetta 2，培养转化体，经IPTG诱导，对培养物包涵体洗涤、溶解，用His标签蛋白磁珠纯化后，透析复性、纯化得到重组蛋白PPV VP2，-80℃保存备用；

S4：将S3制得的重组蛋白PPV VP2稀释，点样在芯片载体上，所述芯片载体为环氧基片，干燥，封闭，洗涤，制得检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S2中，pColdI质粒和S1合成的PPVVP2基因用限制性内切酶Hind III和Bam H I双酶切，酶切产物胶回收纯化，将纯化的酶切产物用T4Ligase连接，于16℃连接过夜，连接产物转化至大肠杆菌DH5α，并涂布于氨苄抗性的LA平板，37℃培养过夜，提取质粒，进行双酶切切验证，得到酶切和测序鉴定正确的阳性克隆pColdI-VP2。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S4中，所述重组蛋白PPV VP2的稀释方法为用2×蛋白芯片点样液稀释，稀释至浓度为0.05-0.4mg/ml，优选的，0.3-0.4mg/ml；所述点样方式为Personal Arrayer 16接触式点样系统点制芯片；所述干燥条件为37℃干燥过夜；所述封闭方法为，将干燥的环氧基片表面贴上芯片围栏，每个芯片围栏加入100μL1％BSA，37℃封闭2h；所述洗涤方法为，用PBST洗涤5min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，S4中，所述制得检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片保存条件为4℃保存。

5.权利要求1至4任一项权利要求制备的一种检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

S1：将待测血清稀释后，点样至所述检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片上，37℃孵育30-60min，用PBST洗涤5min后干燥；

S2：在S1处理基础上加入100倍稀释的兔抗猪金标二抗于37℃孵育30-60min，用PBST洗涤5min后干燥；

S3：在S2处理基础上加入1:1混合好的银染显色液A液和B液，显色8-15min，用PBST洗涤5min后干燥观察结果。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，S1所述待测血清稀释倍数为10-6000倍，优选的，2000倍。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，S1所述待测血清孵育时间为30-45min，S2所述兔抗猪金标二抗孵育时间为60min。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，S3所述显色时间为10min。

9.权利要求1至4任一项权利要求制备的检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片在制备猪细小病毒抗体检测试剂盒中的应用。

10.一种猪细小病毒抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1至4任一项权利要求制备的检测猪细小病毒抗体的可视化蛋白芯片。