[发明专利]一种产物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及制备方法

说明书

本发明公开了一种产物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及制备方法，属于遗传工程和酶工程领域。本发明通过对P.macerans strain JFB05‑01(CCTCC NO:M208063)的CGTase的156位的丙氨酸(Ala)分别替换为赖氨酸(Lys)、谷氨酰胺(Gln)和缬氨酸(Val)，使染料木素糖基化效率分别提高了23％、44％和32％。这些突变酶比野生型CGTase更利于催化生产糖基化染料木素。

技术领域

本发明涉及一种产物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及制备方法，属于遗传工程和酶工程领域。

背景技术

染料木素(又名金雀异黄素、染料木黄酮等)被认为是一种活性功能最高的大豆异黄酮类物质。在豆科植物中，染料木素经常以其葡萄糖苷衍生物即染料木苷(又名4',5,7-三羟异黄酮-7-糖苷)的形式存在。染料木素在人体及动物细胞中具有广泛的药理学功效。主要表现为：1)具有化学防癌(乳腺癌和前列腺癌等)作用。染料木素具有类雌性激素及抗激素作用，可以抑制肿瘤细胞合成过程中相关酶的活性，在肿瘤细胞形成过程中抑制肿瘤血管增生，延缓或阻止肿瘤变成癌细胞。2)可以预防心血管疾病。染料木素会激发低密度的脂蛋白受体产生正向调节作用，同时可以促进胆固醇的清除，抑制血小板的凝集，对于动脉粥样硬化等疾病具有预防和治疗作用。3)可以预防绝经后疾病。染料木素是典型的植物雌激素，所具有的雌激素活性能够缓解妇女更年期综合症及预防绝经后疾病。4)抗骨质疏松作用。染料木素的雌激素活性能够激活雌激素受体，提高成骨细胞活性；另外还可以增加骨密度，抑制骨量丢失，对骨质疏松具有较好的改善作用。

然而，染料木素具有很强疏水性，几乎不溶于水，在一般的有机溶媒中溶解度较差，而易溶于二甲基亚砜等有机溶剂。由于染料木素在水溶液中的溶解度极低，不仅限制了其作为食品添加剂、化妆品以及其他水溶性产品的应用，而且也大大降低了其作为口服药物及静脉注射药剂的药用效果，限制了其医药行业中的应用。因此，如何提高染料木素在水溶液中的溶解度，成为目前国内外关注的焦点。其中研究较多的是染料木素的糖基化衍生物。据报道二葡萄糖基染料木素和三葡萄糖基染料木素在水中的溶解度分别是染料木素的3700倍和44000倍。糖基化染料木素相比与染料木素具有如下优点：1)与染料木素具有相似的生理生化功能；2)在体内水解为可被人体吸收的葡萄糖与染料木素，安全性较高；3)与染料木素相比水溶性明显的改善，拓展了其的应用范围。因此，糖基化染料木素具有十分重要的应用价值。环糊精葡萄糖基转移酶(EC 2.4.1.19)是目前常见的催化糖基化反应的酶。但是，由于环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)对染料木素糖基化效率(转化率)较低，因此，通过分子改造CGTase技术提高其对染料木素糖基化效率，将推动与染料木素糖基衍生物相关行业的快速发展。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种染料木素糖基化效率提高的环糊精糖基转移酶，与(GenBank accession no.JX412224)所示的环糊精葡萄糖基转移酶的氨基酸序列相比，包括对第156位的丙氨酸进行突变。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶的获得方法为以GenBank JX412224公布的基因为出发基因,将第156位的丙氨酸分别突变成谷氨酰胺A156N，赖氨酸A156K，缬氨酸A156V。

编码所述环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列。

表达述环糊精葡萄糖基转移酶的基因工程菌或转基因细胞系。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种产环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：

1)采用化学全合成或PCR方法克隆编码所述环糊精葡萄糖基转移酶基因；

2)将步骤1)获得的环糊精葡萄糖基转移酶基因连接到大肠杆菌表达载体，得到重组表达载体；