[发明专利]一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法

说明书

一种牛奶中多重抗生素残留(氧四环素和卡那霉素)的比色检测方法，属于分析化学技术领域。本发明首先将抗生素适体(APT)与生物素标记的探针CP退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面；探针SP和HP修饰在金纳米颗粒(AuNPs)表面。在抗生素存在时，抗生素与APT的特异性结合并使APT脱离SDB，紧接着CP则与AuNPs修饰的HP杂交形成SDB‑AuNPs体系；AuNPs表面修饰的SP结合SAv‑HRP后可催化SAv‑HRP后催化TMB‑H₂O₂或OPD‑H₂O₂溶液变色，利用370nm或450nm处紫外吸光度的变化与抗生素浓度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品的紫外吸光度，即可实现抗生素含量的灵敏检测。该方法具有高灵敏度，低成本，易操作等特点，可实现样品中多重抗生素的灵敏测定。

技术领域

本发明是一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，特别是牛奶中多重抗生素的检测方法，属于分析化学领域。

背景技术

抗生素是一类药物，广泛用于预防和治疗许多引起传染病的细菌。抗生素通常通过合成，半合成或天然的方式生产。然而，由于转化的恶性循环和长期不利影响，食品或环境中的抗生素残留已经成为一个严重的问题。不同类型的抗生素残留物可被人体吸收，对人体健康构成严重威胁，因此，为避免这种后果，应建立食品源抗生素残留的实用的抗生素分析方法，对实际生产生活具有重大意义。

金纳米颗粒因其独特的物理和化学性质，被广泛用于信号放大的纳米材料之一。可在其表面偶联其他许多功能分子，成功保持其原有生物特性的同时，拥有更好的稳定性。快速和简化操作的显着优点。磁珠由于其独特的优势，已经成为分离生物技术的优秀工具，磁珠分离技术与其他分离技术(如色谱分离，离心分离和膜分离)相比具有高通量，低成本，因此，建立一种专一性强、操作简便、假阳性误差小，同时，快速、简易、灵敏的抗生素检测方法显得尤为重要。

现今，检测抗生素常见技术主要有色谱法和其联用技术、酶免疫分析法、毛细管电泳法、电化学方法与比色法等。这些方法中的大多数都有一定的缺陷，繁琐的样本预处理程序、免疫化学方法的试剂昂贵、检测时间长、复杂的仪器。因此，通过磁珠分离和金纳米颗粒信号放大可建立一种灵敏高效，价格低廉、假阳性误差小、简便快捷的卡那霉素的检测方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是将磁珠快速分离收集与金纳米颗粒的信号放大的优势结合起来，建立一种简单、成本低廉，极高灵敏度且简便的应用于实际样品中多重抗生素含量的检测方法。

本发明的技术方案：本发明是一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，首先将抗生素适体(APT)与生物素标记的探针CP退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面，探针SP和HP修饰在金纳米颗粒(AuNPs)表面；在抗生素存在时，抗生素与APT的特异性结合并使APT脱离SDB，紧接着CP则与AuNPs修饰的HPKNA杂交形成SDB-AuNPs体系；AuNPs表面修饰的SP结合SAv-HRP后可催化TMB-H₂O₂或OPD- H₂O₂溶液变色，利用370nm或450nm处紫外吸光度的变化与抗生素浓度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品的紫外吸光度，即可实现抗生素含量的灵敏检测。该方法具有高灵敏度，低成本，易操作等特点，可实现样品中多重抗生素的灵敏测定。

方法包括以下步骤：SDB的预处理、探针修饰SDB的制备、金纳米颗粒的制备、探针修饰AuNPs的制备、样品孵育，紫外分光光度计检测。

(1)磁珠的预处理

取10mg/mL的链霉亲和素偶联磁珠(SDB)原液于EP管中，加入含有1mM EDTA， 2MNaCl的10mM Tris-HCl(pH 7.5)冲洗磁珠3次，最后用10mM PBS(pH 7.0)重悬SDB，得到2mg/mL干净磁珠备用。

(2)探针修饰SDB的制备