[发明专利]一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法

权利要求书

1.一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，首先将20μL 10μM抗生素适体APT与20μL 10μM生物素标记的探针CP在90℃退火杂交形成双链DNA修饰在50μL 10mg/mL链霉亲和素偶联磁珠SDB表面，探针40μL 10μM的SP和4μL 10μM的HP修饰在100μL金纳米颗粒AuNPs表面；在一系列标准浓度的氧四环素存在时，溶液颜色从透明逐渐变为深蓝色，利用370nm处紫外吸光度的变化与氧四环素浓度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品的紫外吸光度，即可实现氧四环素含量的灵敏检测；在一系列标准浓度的卡那霉素存在时，溶液颜色从透明逐渐变为深黄蓝色，利用450nm处紫外吸光度的变化与卡那霉素浓度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品的紫外吸光度，即可实现卡那霉素含量的灵敏检测。

2.根据权利要求1所述的一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，其特征是将抗生素适体APT与生物素标记的探针CP退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠SDB表面，将20μL 10μM APT和20μL 10μM CP加入到210μL含0.3M NaCl，pH值为7.0的10mM PBS中，90℃加热2min后缓慢降至室温，之后加入50μL SDB，37℃孵育90min，用pH值为7.0的10mM PBS洗涤3次后，加入500μL 2％BSA室温孵育1h后，将CP_OTC/APT_OTC修饰的SDB和CP_KAN/APT_KAN修饰的SDB分别重悬于50μL pH值为7.0的10mM PBS溶液中，最后将得到的CP_OTC/APT_OTC修饰的SDB和CP_KAN/APT_KAN修饰的SDB等体积混匀。

3.根据权利要求2所述的一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，其特征是生物素修饰的探针SP和HP通过巯基修饰在AuNPs表面，将制备的AuNPs 100μL加入4μL 10μM的HP、40μL 10μM的SP和356μL pH值为7.0的10mM PBS于37℃孵育1h，12000rpm，4℃离心20min，用pH值为7.0的10mM PBS重复离心洗涤3次得到HP_OTC/SP_OTC修饰的AuNPs和HP_KNA/SP_KNA修饰的AuNPs。

4.根据权利要求3所述的一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，其特征是当体系中存在抗生素即氧四环素和卡那霉素时，抗生素与APT的特异性结合并使APT脱离SDB，紧接着CP则与AuNPs修饰的HP杂交形成SDB-AuNPs体系，将上述权利要求3中CP_OTC/APT_OTC修饰的SDB和CP_KAN/APT_KAN修饰的SDB混合物4μL、4μL不同浓度氧四环素或卡那霉素和2μL含0.1MNaCl，pH值为7.4的10mM PBS制成混合液并于37℃孵育1h，用pH值为7.0的10mM PBS洗涤后加入12.5μL上述权利要求3中HP_OTC/SP_OTC修饰的AuNPs或HP_KNA/SP_KNA修饰的AuNPs于37℃孵育1h，用100μL pH值为7.0的10mM PBS清洗3次并重悬形成SDB-AuNPs体系。

5.根据权利要求4所述的一种牛奶中多重抗生素残留的比色检测方法，其特征是AuNPs表面修饰的SP结合SAv-HRP后可催化TMB-H₂O₂或OPD-H₂O₂溶液变色，利用370nm或450nm处紫外吸光度的变化与抗生素浓度的关系，测定一系列标准浓度抗生素的紫外吸光度的大小绘制标准曲线，通过测量待测样品的紫外吸光度，即可实现抗生素含量的灵敏检测，将上述权利要求4中形成SDB-AuNPs体系中加入0.5μL 0.01mg/mL的SAv-HRP于37℃下孵育1h，用200μL pH值为6.0的10mM PBS清洗5次，加600μL TMB-H₂O₂或OPD-H₂O₂溶液重悬磁珠于37℃孵育30min后观察颜色变化并检测370nm或450nm处紫外吸光度，测定一系列标准浓度抗生素的紫外吸光度的大小绘制标准曲线，绘制标准曲线，用人工污染牛奶的方法获得氧四环素或卡那霉素的牛奶样品替代上述不同浓度的氧四环素或卡那霉素标准溶液，得到紫外吸光度通过标准曲线可计算出实际牛奶中抗生素的浓度。