[发明专利]一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法

说明书

一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，属于分析化学技术领域。本发明首先将氧四环素适体(APT_OTC)与生物素标记的探针CP_OTC退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面；探针SP_OTC和HP_OTC修饰于金纳米颗粒(AuNPs)表面。当体系中存在氧四环素(OTC)时，OTC与APT_OTC的特异性结合并使APT_OTC脱离SDB，紧接着CP_OTC则与AuNPs修饰的HP_OTC杂交形成SDB‑AuNPs体系；AuNPs表面修饰的SP_OTC结合SAv‑HRP后可催化TMB‑H₂O₂溶液变色，利用370nm处紫外吸光度的变化与氧四环素浓度梯度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品370nm处紫外吸光度，即可实现氧四环素浓度的检测。该方法具有高灵敏度，低成本，快速、易操作等特点，可实现样品中氧四环素的灵敏测定。

技术领域

本发明是一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，特别是牛奶中氧四环素残留的检测方法，属于分析化学领域。

背景技术

氧四环素是一种四环素类广谱抗生素和生长促进剂，常常被用作饲料添加剂，由于氧四环素的不合理使用以及不遵守休药期(WDT)等，极易残留在牛奶和动物组织中，长期食用必然会危及人类的健康。世界粮农组织、世界卫生组织、欧盟及我国政府对牛奶中氧四环素的残留都做出了严格的规定，控制氧四环素的使用。

磁珠分离技术与其他分离技术(如色谱分离，离心分离和膜分离)相比具有高通量，低成本，快速和简化操作的显着优点。金纳米颗粒(AuNPs)因其独特的物理和化学性质，被广泛用于信号放大的纳米材料之一。可在其表面偶联其他许多功能分子，成功保持其原有生物特性的同时，拥有更好的稳定性。通过DNA探针修饰磁珠识别抗生素和AuNPs信号放大可建立一种超灵敏建立高效，实用的、简便、快速、灵敏检测氧四环素的方法。

目前抗生素分析的方法包括ELISA，色谱，质谱，毛细管电泳，SERS，表面等离子体共振(SPR)和电化学生物传感器学。这些方法中的大多数都有一定的缺陷，繁琐的样本预处理程序、免疫化学方法的试剂昂贵、检测时间长、复杂的仪器。因此，利用磁珠快速分离收集与金纳米颗粒的信号放大的优势建立一种专一性强、操作简便、快速、灵敏的氧四环素检测方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是将磁珠快速分离收集与金纳米颗粒的信号放大的优势结合起来，建立一种简单、成本低廉，极高灵敏度的应用于实际样品中氧四环素浓度的检测方法。

本发明的技术方案：一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，首先将氧四环素适体(APT_OTC)与生物素标记的探针CP_OTC退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠(SDB)表面；探针SP_OTC和HP_OTC修饰于金纳米颗粒(AuNPs)表面。当体系中存在氧四环素(OTC)时，OTC与APT_OTC的特异性结合并使APT_OTC脱离SDB，紧接着CP_OTC则与AuNPs修饰的HP_OTC杂交形成SDB-AuNPs体系；AuNPs表面修饰的SP_OTC结合SAv-HRP后可催化TMB-H₂O₂溶液变色，利用370nm处紫外吸光度的变化与氧四环素浓度的关系，测定一系列标准浓度的氧四环素所得的紫外吸光度的大小，绘制标准曲线，即可实现实际样品中氧四环素含量的灵敏检测。

方法包括以下步骤：磁珠的预处理、探针修饰SDB的制备、金纳米颗粒的制备、探针修饰AuNPs的制备、样品孵育，紫外分光光度计检测。

(1)磁珠的预处理