[发明专利]一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法

权利要求书

1.一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，首先将20μL 10μM氧四环素适体APT_OTC与20μL 10μM生物素标记的探针CP_OTC在90℃退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠SDB表面，探针40μL 10μM的SP_OTC和4μL 10μM的HP_OTC修饰于100μL金纳米颗粒AuNPs表面；当体系中存在一系列标准浓度的氧四环素OTC时，溶液颜色从透明逐渐变为深蓝色，利用370nm处紫外吸光度的变化与氧四环素浓度梯度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品370nm处紫外吸光度，即可实现氧四环素浓度的检测。

2.根据权利要求1所述的一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，其特征是将氧四环素适体APT_OTC与生物素标记的探针CP_OTC退火杂交形成双链DNA修饰在链霉亲和素偶联磁珠SDB表面，将20μL 10μM APT_OTC和20μL 10μM CP_OTC加入到210μL含0.3M NaCl，pH值为7.0的10mM PBS中，90℃加热2min后缓慢降至室温，之后加入50μL SDB，37℃孵育90min，用pH值为7.0的10mM PBS洗涤3次后，加入500μL 2％BSA室温孵育1h后，将CP_OTC/APT_OTC修饰好的SDB重悬于50μLpH值为7.0的10mM PBS溶液中。

3.根据权利要求2所述的一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，其特征是探针SP_OTC和HP_OTC修饰于金纳米颗粒AuNPs表面，将100μL的AuNPs与4μL 10μM的HP_OTC、40μL 10μM的SP_OTC以及356μL pH值为7.0的10mM PBS混合，37℃孵育1h后，12000rpm，4℃离心20min，用pH值为7.0的10mM PBS重复离心洗涤3次得到HP_OTC/SP_OTC修饰的AuNPs。

4.根据权利要求3所述的一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，其特征是当体系中存在氧四环素OTC时，OTC与APT_OTC的特异性结合并使APT_OTC脱离SDB，紧接着CP_OTC则与AuNPs修饰的HP_OTC杂交形成SDB-AuNPs体系，将上述权利要求2中CP_OTC/APT_OTC修饰的SDB 4μL、4μL不同浓度的OTC和2μL含0.1M NaCl，pH值为7.4的10mM PBS制成混合液并于37℃孵育1h，用pH值为7.0的10mM PBS洗涤后加入12.5μL上述权利要求3中HP_OTC/SP_OTC修饰的AuNPs于37℃孵育1h，用100μL pH值为7.0的10mM PBS清洗3次并重悬形成SDB-AuNPs体系。

5.根据权利要求4所述的一种牛奶中氧四环素残留的比色检测方法，其特征是利用370nm处紫外吸光度的变化与氧四环素浓度梯度的关系，绘制标准曲线，通过测量待测样品在370nm处的紫外吸光度，即可实现氧四环素浓度的检测，将上述权利要求4中形成的SDB-AuNPs体系中加入0.5μL SAv-HRP于37℃下孵育1h，用200μL pH值为6.0的10mM PBS清洗5次，加600μL TMB-H₂O₂溶液重悬于37℃孵育30min观察颜色变化并检测370nm处紫外吸光度，检测一系列标准浓度的氧四环素的紫外吸光度，绘制标准曲线，用人工污染牛奶的方法获得氧四环素的牛奶样品替代上述一系列标准浓度的氧四环素，得到牛奶样品的紫外吸光度，通过标准曲线可计算出实际牛奶中氧四环素的浓度。