[发明专利]天然组织来源的肌腱复合肌肉脱细胞材料的制备方法

说明书

本发明公开了一种天然组织来源的肌腱复合肌肉脱细胞材料的制备方法，将哺乳动物任意大小的肌腱复合肌肉组织经含蛋白酶抑制剂的PBS、含KCl的PBS缓冲液、含KI的PBS缓冲液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液、含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得天然组织来源的肌腱复合肌肉脱细胞材料。本发明能对组织上的细胞进行完全去细胞化处理，且条件温和、无ECM损害、快速稳定。所得的材料，不仅最大限度的模拟了天然的肌腱复合肌肉的分层结构、较好的保留了细胞外基质成分、还具有极低的免疫原性，较强的力学性能等优点，可用于修复临床上各类病因造成的肌肉损伤、退变相关疾病。

技术领域

本发明主要涉及用于全身骨骼肌肉组织修复及其再生的医学领域，具体是一种天然组织来源的肌腱复合肌肉脱细胞材料的制备，该生物支架在去除免疫原性的细胞成分同时，较好的保留了天然的肌腱复合肌肉的分层结构、细胞外基质成分、具有较强的力学性能，并且该材料能促进肌肉缺损的修复和再生。

背景技术

由创伤，不合理的运动，退行性疾病等造成的肌肉损伤在临床上十分常见，严重影响患者的生活质量。组织工程的广泛应用在攻克这方面的疾病中取得了一定的进步，目前的研究主要集中在制备一个单纯的肌肉支架来诱导肌纤维再生，但是效果并不理想。第一：生理状况下，肌纤维与肌腱或者肌筋膜相连接，而正是通过肌肉肌腱的连接部分形成一个的网络结构，单个肌纤维形成收缩总和，产生高效的运动，而单纯的肌肉支架缺乏这个结构。第二：单纯的肌肉支架力学性能较差(最大应力为0.1-5Mpa)，易在大块腹部缺陷或肢体肌肉缺陷的高张力下破裂，而肌腱支架的最大应力水平为30-1000Mpa，它能提供稳定的力学支持。因此，肌腱复合肌肉支架，具有完整的机械传导系统更适合肌肉组织工程。

由于天然的肌腱复合肌肉组织，尤其是两者的交界部分相当复杂，目前很少有研究能创造完全模拟天然的肌腱复合肌肉结构的支架，无法实现很好的肌肉缺损的修复和再生。脱细胞技术能提供一种潜在的解决方案，脱细胞支架在去除免疫原性的细胞组分同时，较好的模拟天然的组织结构并保留细胞外基质成分，目前肌腱复合肌肉脱细胞支架还未见报道。因此本发明通过创新的脱细胞技术制备了一种天然的肌腱复合肌肉脱细胞支架，在去除细胞的同时，最大化模拟了天然的肌腱复合肌肉结构，证明了该支架具有极低的免疫原性，具有较强的力学性能，较好的保留了天然的肌腱复合肌肉组织的细胞外基质组分，并且证实该支架在体内能很好的修复的肌肉缺损，在肌肉再生组织工程中有极大的意义。

发明内容：

本发明目的在于填补现有技术中，尚无肌腱复合肌肉支架制备的报道，提供一种具有极低免疫原性的，良好的力学性能的，较好保留细胞外基质组分的，并能促进肌肉缺损再生的脱细胞肌腱复合肌肉支架的制备方法。

天然组织来源的肌腱复合肌肉脱细胞材料的制备方法，该方法具体包括以下步骤：

(1)取宰杀12h以内任意哺乳动物的肌腱复合肌肉组织，用剪刀除去肌肉以及肌腱上的脂肪，用含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液漂洗3次，每次30min，去除血液，贴附的脂肪碎片和其他杂质；

(2)在含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，在4℃温度下用摇床100rpm震荡24-48小时；然后用液氮冻融3个循环；

(3)在KCL的PBS缓冲液中，加入混合抗菌液，在4℃温度下用摇床100rpm震荡2-12小时；

(4)在KI的PBS缓冲液中，加入混合抗菌液，在4℃温度下用摇床100rpm震荡2-12小时；

(5)在含Triton X的PBS缓冲液中，加入混合抗菌液，在4℃温度下用摇床100rpm震荡24-48小时；

(6)在含SDS的PBS缓冲液中，加入混合抗菌液，在4℃温度下用摇床100rpm震荡24-48小时；

(7)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入混合抗菌液，在37℃温度下用摇床120rpm震荡12-24小时；