[发明专利]缓释IGF-1生长因子的肌肉脱细胞材料的制备方法

说明书

本发明提出了一种缓释IGF‑1生长因子的肌肉脱细胞材料的制备方法，本发明将哺乳动物任意大小的骨骼肌肉组织经含蛋白酶抑制剂的PBS、含KCl的PBS缓冲液、含Triton X的PBS缓冲液、含SDS的PBS缓冲液、含DNA酶的PBS缓冲液处理，获得可自发、持续缓释IGF‑1生长因子的脱细胞肌肉材料。本发明能同时对肌肉组织上的细胞进行完全去细胞化处理，且条件温和、无ECM损害、快速稳定，所得肌肉脱细胞材料不仅可以自发、持续缓释IGF‑1生长因子，还具有生物相容性好、可塑性强、生物力学强度高等优点，可用于修复临床上各类病因造成的肌肉损伤、退变相关疾病。

技术领域

本发明主要涉及用于全身骨骼肌肉组织修复及其再生的医学领域，具体是一种新型的肌肉脱细胞材料的制备，该生物支架能自发持续释放IGF-1-1生长因子，且较好的保留了天然肌肉组织的细胞外基质成分，该材料能促进大面积肌肉缺损的修复和再生。

背景技术

虽然骨骼肌在损伤之后有一定的自我修复能力，但是急性、超过20％面积的肌肉损伤常常导致缺损处无法修复，往往由大量的疤痕纤维组织替代，我们称之为大面积肌肉缺损。目前，没有有效治疗手段能促进大面积肌肉缺损的修复和再生。

在骨骼肌细胞外基质(ECM)重塑和肌肉再生过程中，通过释放一系列生长因子,激活肌卫星细胞促进肌纤维分化，并最终促进骨骼肌再生。因此，生长因子对肌肉再生有着重要的意义。而胰岛素样生长因子-1(IGF-1-1)通过促进卫星细胞增殖和肌原性的分化，血管内皮细胞介导的血管生成以及神经元存活和轴突再生等多种途径而强有力的促进肌肉修复再生。但是通过传统技术制备的肌肉脱细胞材料，其IGF-1生长因子往往不能被很好保留，更无法达到持续缓释。能够自发、持续缓释IGF-1生长因子的脱细胞肌肉支架还未见报道。

单独的应用IGF-1或者将IGF-1加到人工合成材料中去修复大面积肌肉缺损结果并不理想，因为肌卫星细胞的增殖分化需要在数天后(3-7天)，而目前报道的IGF-1释放的最大效能只维持在10-24小时之间。而且人造的合成材料相较于天然的肌肉ECM缺少天然的细胞生长发育所需微环境，无法实现很好的肌肉修复再生。因此本发明通过创新的脱细胞技术制备能自发、持续释放IGF-1生长因子的新型脱细胞肌肉生物支架，并且证实该支架在体内能很好的修复大面积的肌肉缺损同时能恢复受损肌肉组织中的血管和神经再生，在肌肉再生组织工程中有极大的意义。

发明内容

本发明目的在于填补现有技术中，脱细胞肌肉材料不能保留并且缓释IGF-1生长因子而影响肌肉缺损的修复再生，提供一种能自发、持续释放IGF-1生长因子，并且较好促进大面积肌肉缺损再生的新型脱细胞肌肉生物支架的制备方法。

(1)取12h以内宰杀的任意哺乳动物的骨骼肌肉组织，用剪刀除去肌肉上的脂肪，用含蛋白酶抑制剂的生理盐水漂洗3次，每次20min，去除血液，贴附的脂肪碎片和其他杂质。

(2)在含蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，在4o C温度下用摇床100rpm震荡24-48小时；然后用液氮冻融3个循环；

(3)在KCL的PBS缓冲液中，加入混合抗菌液，在4o C温度下用摇床100rpm震荡2-12小时；

(4)在含Triton X的PBS缓冲液中，加入混合抗菌液，在4o C温度下用摇床100rpm震荡8-24小时；

(5)在含NaCL的PBS缓冲液中，在4o C温度下用摇床100rpm震荡2-12小时；

(6)在含SDS的PBS缓冲液中，加入混合抗菌液，在4o C温度下用摇床100rpm震荡8-24小时；

(7)在含DNA酶的PBS缓冲液中，加入混合抗菌液，37℃摇床100rpm震荡6-12小时；

步骤(2)-(7)中，每个步骤完成后均用生理盐水冲洗5小时。