[发明专利]基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用

说明书

本发明提供了一种基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用。具体地，本发明提供了一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，该体系包含向导ssDNAs，基因编辑酶Pyrococcus furiosus Argonaute(PfAgo)和荧光报告核酸。本发明的核酸检测方法灵敏度高、特异性好、通量高，可广泛应用于分子医学诊断、食品安全检测以及环境监测等诸多领域。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用。

背景技术

核酸检测技术广泛应用于分子医学诊断、食品安全检测以及环境监测等诸多领域。快速、廉价和灵敏的核酸检测可广泛应用于病原体检测、基因分型、病程监测等方面。

一些传统的核酸检测方法(qPCR、测序、核酸印记等)虽然已经有广泛应用，然而，仍存在一些缺点。例如qPCR和高通量测序等存在耗时长，费用高，设计原理复杂等缺点。此外，对于数量极其微少的待检测核酸，本领域尚缺乏令人满意的检测方法。

目前，利用基因编辑酶作为核酸检测的方法有利用C2C2酶介导的旁系剪切效应对目标RNA进行检测。但是尚缺乏对目标DNA(尤其是微量DNA)进行快速、有效检测的方法。

因此，本领域迫切需要开发针对目标DNA的灵敏度高、特异性好、通量高的核酸检测方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种基于对目标DNA的灵敏度高、特异性好、通量高的核酸检测方法及其应用。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，该体系包含：

(a)向导ssDNA对；

(b)基因编辑酶Pyrococcus furiosus(PfAgo)；和

(c)荧光报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和淬灭基团；

其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA。

在另一优选例中，所述的向导ssDNA对包括有义链向导ssDNA和反义链向导ssDNA。

在另一优选例中，所述的向导ssDNA为5’-磷酸化的单链DNA分子。

在另一优选例中，所述的向导ssDNA的长度为n个碱基，且n≥14。

在另一优选例中，所述的n≤100，较佳地≤80，更佳地≤60。

在另一优选例中，所述的向导ssDNAs的长度为14-60nt，较佳地16-40nt。

在另一优选例中，所述的向导ssDNAs的数量为一对或多对。

在另一优选例中，所述PfAgo酶来源于古菌Pyrococcus furiosus。

在另一优选例中，所述的PfAgo包括野生型和突变型的PfAgo。

在另一优选例中，所述靶标核酸分子的不同分型对应的突变位点在向导ssDNA的第10、11位。

在另一优选例中，所述的检测体系还含有(d)缓冲液。

在另一优选例中，所述的检测体系还包括用于对靶标核酸分子进行扩增的引物。

在另一优选例中，所述的检测体系还含有待检测的靶标核酸分子。

在另一优选例中，所述的靶标核酸分子(或其扩增产物)被所述PfAgo酶切割后，产生次级向导ssDNA。

在另一优选例中，所述的次级向导ssDNA与所述的荧光报告核酸的序列是互补的。