[发明专利]基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用

权利要求书

1.一种用于检测靶标核酸分子的检测体系，其特征在于，该体系包含：

(a) 向导ssDNA对，所述的向导ssDNA对包括有义链向导ssDNA和反义链向导ssDNA，所述的向导ssDNA的长度为14-60nt，并且所述的向导ssDNA为5’-磷酸化的单链DNA分子；

(b) 基因编辑酶Pyrococcus furiosus Argonaute；和

(c) 荧光报告核酸，所述荧光报告核酸带有荧光基团和淬灭基团；

其中，所述的靶标核酸分子为靶标DNA；

所述的靶标核酸分子被所述Pyrococcus furiosus Argonaute酶切割后，产生次级向导ssDNA；所述的次级向导ssDNA与所述的荧光报告核酸的序列是互补的；所述的次级向导ssDNA与所述的荧光报告核酸的序列互补结合后，引导所述Pyrococcus furiosus Argonaute酶对所述荧光报告核酸进行切割，从而产生可检测的信号。

2.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的向导ssDNAs的长度为16-40nt。

3.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述靶标核酸分子的不同分型对应的突变位点在向导ssDNA的第10、11位。

4.如权利要求1所述的检测体系，其特征在于，所述的靶标DNA选自下组：单链DNA、双链DNA、或其组合。

5.一种用于检测靶标核酸分子的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(i) 权利要求1所述的检测体系；和

(ii) 使用说明书，所述说明书描述了用所述的检测体系检测靶标核酸分子的方法。

6.一种非诊断性和非治疗性的检测样本中是否存在靶标核酸分子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a) 提供权利要求1所述的用于检测靶标核酸分子的检测体系；

(b) 将所述检测体系与待检测的样本在一定温度下进行反应，从而形成第一反应溶液；和

(c) 对所述第一反应溶液进行荧光检测，从而获得荧光信号值；

其中，所述第一反应溶液中检测到荧光信号值，则表示所述样本中存在靶标核酸分子；而所述第一反应溶液中没有检测到荧光信号值，则表示所述样本中不存在靶标核酸分子；

所述温度为87-99℃。

7.一种核酸酶Pyrococcus furiosus Argonaute的用途，其特征在于，用于制备基于二次切割检测靶标核酸分子的试剂；

所述二次切割指在向导 ssDNA存在下，Pyrococcus furiosus Argonaute对靶标核酸分子进行剪切，形成次级向导 ssDNA，次级向导 ssDNA在Pyrococcus furiosus Argonaute的作用下，引导Pyrococcus furiosus Argonaute对与次级向导 ssDNA互补的荧光报告核酸进行剪切。

8.一种核酸酶Pyrococcus furiosus Argonaute的用途，其特征在于，用于制备基于二次切割检测靶标核酸分子的试剂盒；

所述二次切割指在向导 ssDNA存在下，Pyrococcus furiosus Argonaute对靶标核酸分子进行剪切，形成次级向导 ssDNA，次级向导 ssDNA在Pyrococcus furiosus Argonaute的作用下，引导Pyrococcus furiosus Argonaute对与次级向导 ssDNA互补的荧光报告核酸进行剪切。