[发明专利]利用突变蛋白检测β-内酰胺类抗生素残留的方法

说明书

本发明属于兽药残留分析技术领域。具体涉及利用突变蛋白检测β‑内酰胺类抗生素残留的方法。该蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1，在序列的55,70和563‑564位存在等位基因突变。公开了如SEQ ID NO：2所示蛋白质序列的突变蛋白同时对40种β‑内酰胺类抗生素残留的检测方法，包括：突变位点的设计，构建突变蛋白，对突变蛋白进行诱导表达及纯化，利用突变蛋白建立β‑内酰胺类抗生素残留的检测方法。本发明对35种β‑内酰胺类抗生素测定方法提供了最低检测限、样品回收率及变异系数等技术参数，对本发明的检测方法做了准确度和重复性验证分析，本发明能同时检测35种动物性食源产品中β‑内酰胺类抗生素的残留量。

技术领域

本发明属于兽药残留分析技术领域。具体涉及利用突变蛋白检测β-内酰胺类抗生素残留的方法。本发明 能同时检测同时检测35种动物性食源产品中β-内酰胺类抗生素残留量。

背景技术

β-内酰胺类抗生素是指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素。近50年来，β-内酰胺类抗生素被 用做畜禽的预防、治疗以及促生长。在现代农业生产中，动物性食品中该类抗生素的添加以及对生长发育 的预防性治疗被认为是必不可少的。然而由于该类抗生素的使用不当或滥用造成在动物体内的残留，这危 害到动物食品安全及人类健康。世界各国对抗生素的残留有高度的关注，在动物饲养、生产及销售过程中， 制定各种相关法律法规来规定抗生素的使用及残留检测。

目前β-内酰胺类抗生素已有多种检测方法存在，主要为微生物法、理化分析法、免疫分析法及受体分 析法(Ahmed et al.,2017)。微生物学分析法基于抗生素对微生物生理机能和代谢的抑制作用，大多选用枯草 芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌和藤黄八叠球菌等敏感菌株等作为检测指示菌，该方法操作简单、价格低廉， 适用于基层大量样品的筛选(Ferrini et al.,2008)，但存在检测时间长、稳定性差等缺点，因此很难实现标准 化定量检测。理化分析法对抗生素进行定量或定性分析，准确性高，灵敏度高，但需要昂贵的仪器和专业 的技术，而且前处理程序复杂，不适合基层样品大规模的筛选(Gaudin et al.,2001)。免疫分析法是以抗原抗 体的特异性、可逆性结合为核心反应的分析方法，该方法具有快速简便、灵敏度高、特异性强、处理量大 等特点，但其中抗体制备技术较为复杂，且由于抗体的特异性高，只能同时检测一种或少数几种抗生素。 抗生素受体分析法是基于抗生素和受体之间的特异性识别反应的分析方法，可以同时特异性识别含有具有 活性的β-内酰胺环的青霉素类和头孢菌素类抗生素，从而实现抗生素的多残留检测(程古月et al.,2014)。

目前受体分析法在抗生素的残留检测中应用较多，如β-内酰胺类(Chen et al.,2015,Pazzola et al.,2015)、 四环素(Moeller et al.,2007)、氯霉素、磺胺类(Gaudinet al.,2012,Liang et al.,2013)等抗生素。该技术应用于 β-内酰胺类抗生素的残留检测中的受体蛋白主要种类较多，其中来自肺炎链球菌的PBP2x重组蛋白(Zeng et al.,2013)可用于检测牛奶样品中的15种β-内酰胺类抗生素，来自肺炎链球菌的PBP3重组蛋白(张静2015) 可用于检测牛奶样品中的27种β-内酰胺类抗生素，最低检测限(Limit ofDetection,LOD)为0.26-109.46 μg/kg。

本申请人所在的华中农业大学国家兽药残留基准实验室前期研究了β-内酰胺类抗生素受体的筛选及 ELISA试剂盒研制，构建了原核表达载体pET-28a(+)-BlaR-CTD，表达并纯化得到高纯度的BlaR-CTD蛋白， 以该蛋白为受体建立了牛奶、牛肉、鸡肉组织中β-内酰胺类抗生素残留的检测方法，头孢喹肟的LOD为 0.43μg·L^-1，低于欧盟和我国的MRL(Peng et al.,2013)。然而该研究中蛋白对氯唑西林、头孢氨苄、头孢羟 氨苄的亲和力较差，且蛋白的稳定性较差。

发明内容