[发明专利]科氏梭菌特异性探针及其用途

说明书

本发明属于微生物学和分子生物学交叉技术领域，具体涉及一种科氏梭菌特异性探针及其用于检测窖泥中科氏梭菌含量的用途和方法。针对现有技术中还未见有采用荧光原位杂交检测科氏梭菌数量的方法的问题，本发明提供一种基于科氏梭菌16S rRNA保守端序列设计特异性的互补核酸探针，命名KCLZ，序列如SEQ ID NO：1所示。应用本发明的KCLZ探针，可特异性的检测酿酒窖泥等样品中的科氏梭菌，为准确剖析浓香型白酒窖池中科氏梭菌随窖龄变迁的规律提供了一种准确，快速的分析手段。

技术领域

本发明属于微生物学和分子生物学交叉技术领域，具体涉及一种科氏梭菌特异性探针及其用于检测窖泥中科氏梭菌含量的用途和方法。

背景技术

科氏梭菌(Clostridium kluyveri)为严格厌氧微生物，主要分布在水和黑土中。1937年在奥氏甲烷杆菌污染物中首次发现，并于1942将其定名。该菌细胞呈杆状，能运动，能由乙醇和乙酸产生丁酸，进而合成己酸。因己酸及己酸乙酯在浓香型白酒中的重要呈香作用，科氏梭菌备受广大酿酒研究者的青睐。

科氏梭菌是梭菌属中产己酸能力较高的菌株，是迄今为止能在培养液中积累己酸的梭菌属的唯一种，在大曲酒发酵过程中不仅能促进己酸及己酸乙酯的形成，而且还能促进戊酸、庚酸等微量成分的形成，形成浓香型白酒的独特风味，在某种程度上可以决定浓香型白酒的质量与风格。然而，科氏梭菌对氧的敏感性，导致其难以通过纯培养从窖泥中筛选出来，对于科氏梭菌定量分析时，其结果往往是局限的，不能准确地反应科氏梭菌在窖泥中的含量，及对白酒风味的贡献作用。为了实现对浓香型白酒酿造窖池中科氏梭菌更加准确和快速的定量分析，急需开发更加有效的针对科氏梭菌的免培养定量分析方法。

借助分子生物学方法进行特异微生物的快速检测和鉴定已成为现代微生物诊断和生态学研究的重要手段。目前窖泥中的科氏梭菌检测鉴定主要采用PCR-DGGE，qPCR、核酸测序等方法。但是，这些基于PCR的方法可能会在扩增反应中引入误差，降低了所得信息的精确度。在实际工作中，用单一的分子生物学方法并不能完全达到预期的目标，往往需要综合多种分子生物学手段，才能进行全面的分析。

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)是一种不依赖PCR的分子技术，它是一种特异性的微生物图像检测方法。该方法通过荧光标记的核酸探针与微生物胞内高度相似的核酸位点杂交，并在激发光照射下发射荧光，可用于微生物的检测和定位。

现有技术中还未见有采用荧光原位杂交检测科氏梭菌数量的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：现有技术中还未见有采用荧光原位杂交检测科氏梭菌数量的方法的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种科氏梭菌特异性探针及其用于检测窖泥中科氏梭菌含量的用途和方法。

本发明提供了一种科氏梭菌特异性探针，命名为KCLZ，其核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示。

SEQ ID NO：1 科氏梭菌特异性探针的核苷酸序列

5’-3’：cctgcacaccctttacgcccagtaattccggacaa。

特别的，上述科氏梭菌特异性探针中，在探针的5’端还连接有花青染料荧光素CY3。

其中，上述科氏梭菌特异性探针的制备方法为：下载NCBI数据库中梭菌科所有微生物的16S rRNA中的全长序列，并进行16S rRNA比对，找出种内保守，种间特异的一段寡核苷酸序列SEQ ID NO：2，根据SEQ ID NO：2进行设计合成。

SEQ ID NO：2 设计探针KCLZ的核苷酸序列