[发明专利]科氏梭菌特异性探针及其用途

权利要求书

1.科氏梭菌特异性探针，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的科氏梭菌特异性探针，其特征在于：在探针的5’端还连接有花青染料荧光素CY3。

3.权利要求1或2所述的科氏梭菌特异性探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：下载NCBI数据库中梭菌科所有微生物的16S rRNA中的全长序列，并进行16S rRNA比对，找出种内保守，种间特异的一段寡核苷酸序列SEQ ID NO：2，根据SEQ ID NO：2进行设计合成。

4.权利要求1或2所述的科氏梭菌特异性探针在检测科氏梭菌含量中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述科氏梭菌为酿酒窖泥中的科氏梭菌。

6.采用权利要求1或2所述的科氏梭菌特异性探针检测酿酒窖泥中科氏梭菌的方法，包括以下步骤：

a、样品处理

将待测样品用焦磷酸钠溶液稀释后，涂于载玻片上，35～40℃保温1.5～2h，脱水、风干，再取溶菌酶溶液涂于载玻片上，孵育0.5～2h；

b、探针杂交

将步骤a得到的载玻片脱水、风干，将科氏梭菌特异性探针溶液滴加至载玻片上，40～45℃避光杂交1.5～2.5h，在提前预热至45～50℃的清洗缓冲溶液中洗涤0.5～1h，干燥，采用抗荧光淬灭剂封片，-20℃避光存放；

c、荧光显微镜观察

采用绿光作为激发光，荧光显微镜下观察，计算得到科氏梭菌的含量。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤a中所述待测样品稀释前，先采用多聚甲醛溶液对所收集菌体细胞进行固定，离心，弃上清后，加入pH 7.0～8.0的PBS缓冲液定容。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤a中所述稀释后的菌体浓度为10⁶～10⁷个细胞/mL。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤b中所述的科氏梭菌特异性探针溶液是指20～30ng/μL的探针与杂交缓冲溶液按体积比1︰9混合而成的溶液；所述杂交缓冲溶液组成为：每L杂交缓冲溶液中含有2.42g Tris-HCl，1.46g EDTA，0.1g SDS，52.65g NaCl，0.3L甲酰胺，余量为水。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤b中所述洗涤采用清洗缓冲溶液，所述清洗缓冲溶液组成为：每L清洗缓冲溶液中含有2.42g Tris-HCl，2.92g EDTA，0.1g SDS和18.02g NaCl，余量为水。