[发明专利]用于筛选和鉴定功能性lncRNA的方法

说明书

本发明涉及通过靶向真核细胞基因组剪接位点对非编码RNA(lncRNA)进行基因干扰的方法。

发明领域

本发明涉及通过靶向真核细胞基因组中的剪接位点对长非编码RNA(lncRNA)进行基因干扰，从而筛选和鉴定功能性lncRNA。

发明背景

作为强大的基因组编辑工具，CRISPR-Cas9系统已用于通过大规模筛选鉴别基因功能^1-4。即使在基因组规模，基因干扰大多通过外显子内生成的移码突变实现。在人类基因组中除约2％的蛋白编码基因，更多的证据表明剩余的大量转录物为非编码RNA⁵。其中，200核苷酸的lncRNA代表无明显蛋白编码潜力的大多数基因^6-7。之前的研究表明人类lncRNA的总数超过了蛋白编码基因的总数且该数字持续攀升⁸。

lncRNA通过顺式或反式调节基因表达在转录或转录后水平，并在多种细胞过程中起关键作用⁹。尽管人类基因组中数万基因座已被标注为编码长非编码RNA(lncRNA)，但其功能大多尚未人所知，主要是由于缺乏可扩展的导致该种基因功能丧失的方法。一般而言，由于lncRNA对阅读框的改变并不敏感，因此难以以常规的方式应用CRISPR-Cas9系统来破坏其表达，更不必说在大的规模范围内应用CRISPR-Cas9系统破坏其表达了。我们之前开发了通过pgRNA文库用于lncRNA的功能丧失筛选的缺失策略⁹，但扩大其规模仍是艰难的。尽管有研究证明基于RNA干扰^10,11或CRISPR¹²的筛选对于lncRNA功能的鉴别有效，但RNAi方法具有潜在的脱靶问题¹³，且两种方法都受到转录敲低的有效性的限制。因此，本领域存在寻找筛选和鉴定功能性长非编码RNA的有效方法和以大规模方式干扰非编码RNA功能的有效方法。

发明概述

本发明提供用于研究基因组区域的功能、以及用于筛选和鉴定具有调节功能的lncRNA的方法。这些方法部分依赖于本文提供的以新开发的CRISPR/Cas系统为基础的文库筛选。

具体地，本发明涉及：

1.用于在真核细胞基因组中干扰长非编码RNA的CRISPR/Cas指导RNA构建体，其包含与启动子可操作连接的靶向长非编码RNA剪接位点周围的基因组序列的指导序列和指导发夹序列。

2.项1的CRISPR/Cas指导RNA构建体，其中所述真核基因组是人基因组。

3.项1或2的CRISPR/Cas指导RNA构建体，其中所述指导序列长度为19-21个核苷酸。

4.项1-3任一项的CRISPR/Cas指导RNA构建体，其中所述发夹序列长度为约40个核苷酸且一旦转录其可与CRISPR/Cas核酸酶结合。

5.项1-4任一项的CRISPR/Cas指导RNA构建体，其中所述指导序列靶向长非编码RNA的SD位点或SA位点周围跨越-50-bp至+75-bp的区域内的基因组序列。

6.项5的CRISPR/Cas指导RNA构建体，其中所述指导序列靶向长非编码RNA的SD位点或SA位点周围跨越-30-bp至+30-bp的区域内的基因组序列。

7.项6的CRISPR/Cas指导RNA构建体，其中所述指导序列靶向长非编码RNA的SD位点或SA位点周围跨越-10-bp至+10-bp的区域内的基因组序列。

8.项1-7任一项的CRISPR/Cas指导RNA构建体，其为病毒载体或质粒。

9.一种文库，其包含多个项1-8任一项的CRISPR/Cas指导RNA构建体。

10.一种存储液体，其包含项1-8任一项的CRISPR/Cas指导RNA构建体或项9的文库。