[发明专利]用于筛选和鉴定功能性lncRNA的方法

权利要求书

1.用于在真核细胞基因组中干扰长非编码RNA的CRISPR/Cas指导RNA构建体，其包含与启动子可操作连接的靶向长非编码RNA剪接位点周围的基因组序列的指导序列和指导发夹序列,

其中所述指导序列靶向长非编码RNA的SD位点或SA位点周围跨越-10-bp至+10-bp的区域内的基因组序列。

2.权利要求1的CRISPR/Cas指导RNA构建体，其中所述真核基因组是人基因组。

3.权利要求1或2的CRISPR/Cas指导RNA构建体，其中所述指导序列长度为19-21个核苷酸。

4.权利要求1或2的CRISPR/Cas指导RNA构建体，其中所述发夹序列长度为40个核苷酸且一旦转录其可与CRISPR/Cas核酸酶结合。

5.权利要求1或2的CRISPR/Cas指导RNA构建体，其为病毒载体或质粒。

6.一种文库，其包含多个权利要求1-5任一项的CRISPR/Cas指导RNA构建体。

7.一种存储液体，其包含权利要求1-5任一项的CRISPR/Cas指导RNA构建体或权利要求6的文库。

8.一种宿主细胞，其包含项1-5任一项的CRISPR/Cas指导RNA构建体。

9.权利要求8的宿主细胞，其进一步包含CRISPR/Cas核酸酶和/或CRISPR/Cas核酸酶的编码序列。

10.权利要求8或9的宿主细胞，其进一步包含Cas9核酸酶。

11.权利要求8或9的宿主细胞，其进一步包含整合入其基因组的报告基因构建体。

12.用于干扰或消除真核细胞中长非编码RNA的功能的方法，其包括将靶向长非编码RNA的一个或多个剪接位点周围的一个或多个多核苷酸序列的一种或多种CRISPR/Cas指导RNA引入真核细胞，由此所述一种或多种指导RNA靶向长非编码RNA的一个或多个剪接位点周围的一个或多个多核苷酸序列且在Cas蛋白的存在下切割所述一个或多个多核苷酸序列，导致长非编码RNA的内含子保留和/或外显子跳跃并因此干扰或消除该长非编码RNA的功能，

所述指导RNA靶向长非编码RNA的SD位点或SA位点周围跨越-10-bp至+10-bp的区域内的多核苷酸序列。

13.权利要求12的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9酶。

14.权利要求12-13任一项的方法，其中通过递送系统实现向所述细胞的引入，所述递送系统包括病毒颗粒、脂质体、电穿孔、显微注射、偶联、纳米颗粒、外来体、微泡或基因枪。

15.权利要求14的方法，其中通过包括慢病毒颗粒的递送系统实施向所述细胞的引入。

16.一种通过干扰长非编码RNA的功能抑制肿瘤细胞生长或增殖的方法，包括利用权利要求12-15中任一项的方法鉴定和破坏对肿瘤细胞生长或增殖必需的lncRNA，从而抑制肿瘤细胞生长或增殖。

17.权利要求16的方法，其中对K562细胞生长或增殖必需的lncRNA选自XXbac-B135H6.15、RP11-848P1.5、AC005330.2、AP001062.9、AP005135.2、RP11-867G23.4、LINC01049、DGCR5、RP11-509A17.3、CTB-25J19.1、CTD-2517M22.17、CROCCP2、AC016629.8、CTC-490G23.4、RP11-117D22.1、AC067969.2、RP11-251M1.1、AC004471.9、AC004471.10、AC002472.11、RP11-429J17.7、RP11-56N19.5、TMEM191A、LL22NC03-102D1.18、LINC00410、LL22NC03-23C6.13、RP11-83J21.3、RP11-544A12.4、ANKRD62P1-PARP4P3、CTD-2031P19.5、XXbac-B444P24.8、RP11-464F9.21、TPTEP1、MIR17HG和BMS1P20。