[发明专利]用于FBXO32基因启动子甲基化检测的引物、检测方法及其应用

说明书

本发明公开了一种甲基化检测的引物、检测方法及其应用，包括：(1)特异性扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其中SEQ NO 1的5’端标记生物素，以及特异性测序引物SEQ NO 3；(2)PCR扩增反应试剂、亚硫酸盐处理试剂以及焦磷酸测序相关试剂。本发明具有检测周期短，特异性高，准确度高以及低污染风险等优点，可用于判断待测样本的FBXO32基因启动子甲基化状态，同时检测结果可指导医生进行相关疾病的诊断、治疗及预后评估。

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，是一种FBXO32基因启动子甲基化检测 试剂盒。

背景技术

DNA甲基化成为表观遗传修饰的一个重要方式，基因启动子区的CpG岛在 正常状态下一般是非甲基化的，当其发生甲基化时，常导致基因转录沉寂，使一 些重要基因如抑癌基因、DNA修复基因等丧失功能，从而导致正常细胞的生长 分化调控失常以及DNA损伤不能被及时修复，这些机制与多种肿瘤形成密切相 关。迄今己发现许多恶性肿瘤存在一个或多个肿瘤抑制基因CpG岛甲基化。这 些抑癌基因CpG岛甲基化通过阻止启动子区的碱基序列与转录蛋白复合体及其 他转录因子相结合，或通过甲基化CpG结合蛋白的介导间接增强转录抑制蛋白 的作用，导致相应基因的mRNA表达水平降低或缺失，进而下调蛋白的表达，最终出现细胞生长分化失控，导致癌症的发生。

FBXO32、Skpl、Cullin l和Rocl/Rbxl/Hrtl是构成泛素蛋白连接酶复合体的 四个亚单位。FBXO32是F-box蛋白家族的一员，后三者是泛素连接酶SCF家族 的成员，对靶点底物的降解依赖泛素化。有研究称这种泛素化作用通过 MKK6/p38MAPK信号通路调节。F-box蛋白通过蛋白质相互作用区域与特殊的 底物连接，它通过F-box区域与Skpl捆绑再与复合体相连，参与多种细胞过程 例如信号转导、转录、细胞周期进程、分化、凋亡、肿瘤形成和细胞泛素化等。 研究发现FBXO32可通过表遗传机制使其转录受到抑制并可能与恶性肿瘤的发 生及不良预后有关。有学者在晚期卵巢肿瘤中发现FBXO32的甲基化频率高达 29.3％，并且FBX032的高甲基化可影响患者的预后。此外研究者在贲门癌中发 现FBXO32的甲基化频率高达44.6％，且与TNM分期有关。检测FBXO32的甲 基化为肠癌的早期诊断提供依据，同时对其治疗方案可提供参考，有助于精准医 疗的开展。

目前对于FBXO32启动子甲基化检测的常规方法有：甲基化特异性PCR (MSP)、亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析 (MS-HRM)、荧光定量法。其中MSP法是使用PCR扩增检测来判断样本是否 存在甲基化，该法实用且普遍，但不能做到定量检测，并且存在较高的假阳性风 险；BSP法主要是通过PCR联合sanger测序技术来检测甲基化状态，但由于其 操作繁琐，因此不适合大批量检测，同时挑选克隆的数目可能会影响检测结果， 因此BSP只能算是半定量法；MS-HRM是通过将单碱基序列的差异转变成熔解 曲线的差异，从而判断是否存在甲基化，这种方法对仪器的要求颇高，需要带 HRM模块的荧光定量PCR仪，同时该法只能分析检测片段整体甲基化状态，而 不能明确每个CpG位点的甲基化状态；荧光定量法是基于MSP开发的技术，主 要是在检测中加入了TaqMan探针，从而保证了较高的灵敏度和准确度，但其对 于多个甲基化位点的检测，也只能做到整体化分析，同时探针成本较高，因此该 法较适用于少数位点大量样本检测。

发明内容

本发明的目的在于，提供了一种用于FBXO32基因启动子甲基化检测的引物， 包括一对特异性扩增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其中SEQ NO1的5’端标记生 物素，以及测序引物SEQ NO 3，其碱基序列如下所示：

SEQ NO 1：5’-GGGGTAGTGAGYGAGGTTAGGAG-3’；

SEQ NO 2：5’-AACAAAACCAACCCCCCTCCTAC-3’；

SEQ NO 3：5’-CAACCAAATCAACCTCCC-3’。