[发明专利]用于FBXO32基因启动子甲基化检测的引物、检测方法及其应用

权利要求书

1.用于FBXO32基因启动子甲基化检测引物，其特征在于，包括一对特异性扩增引物SEQNO 1和SEQ NO 2，其中SEQ NO1的5’端标记生物素，以及测序引物SEQ NO 3，其碱基序列如下所示：

SEQ NO 1：5’-GGGGTAGTGAGYGAGGTTAGGAG-3’；

SEQ NO 2：5’-AACAAAACCAACCCCCCTCCTAC-3’；

SEQ NO 3：5’-CAACCAAATCAACCTCCC-3’。

2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，SEQ NO 1：SEQ NO 2的使用浓度之比为0.5μM：0.5μM。

3.一种FBXO32基因启动子甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：

(1)亚硫酸盐处理试剂；

(2)PCR扩增试剂：包括特异性扩增引物SEQ NO1和SEQ NO2；

(3)单链纯化试剂；

(4)焦磷酸测序试剂：包括测序引物SEQ NO3；

所述扩增引物和测序引物的序列如下所示：

SEQ NO 1：5’-GGGGTAGTGAGYGAGGTTAGGAG-3’；

SEQ NO 2：5’-AACAAAACCAACCCCCCTCCTAC-3’；

SEQ NO 3：5’-CAACCAAATCAACCTCCC-3’。

4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述亚硫酸盐处理试剂包括Bisulfite Mix、RNase free water和DNA Protect Buffer。

5.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述单链纯化试剂包括链亲和素beads、70％(V/V)乙醇、8mg/ml NaOH溶液、1×Wash Buffer、结合缓冲液和退火缓冲液。

6.权利要求3至5之一所示的FBXO32基因启动子甲基化检测试剂盒的使用方法包括：

(i)提取样本中的DNA；

(ii)将模板DNA进行亚硫酸盐处理，并纯化回收；

(iii)以步骤(ii)中的纯化回收产物为模板，依据所述的特异性扩增引物SEQ NO1和SEQ NO 2进行两轮PCR扩增；

(iiii)将PCR产物进行单链纯化之后，将其置于焦磷酸测序仪中测序；

(iiiii)依据相关软件获得样本的FBXO32启动子甲基化状态；

所述扩增引物和测序引物的序列如下所示：

SEQ NO 1：5’-GGGGTAGTGAGYGAGGTTAGGAG-3’；

SEQ NO 2：5’-AACAAAACCAACCCCCCTCCTAC-3’；

SEQ NO 3：5’-CAACCAAATCAACCTCCC-3’。

7.如权利要求6所述的使用方法，其特征在于，步骤(iii)的所述第一轮扩增条件为：95℃15min预变性；94℃30s，64-56℃30s每循环(-0.5℃)，72℃1min，16个循环；94℃30s，60℃30s，72℃1min，24个循环，72℃10min；所述的第二轮扩增条件为95℃15min预变性；94℃30s，60℃30s，72℃1min，40个循环，72℃10min。

8.如权利要求7所述的使用方法，其特征在于，步骤(iiiii)，包括以亚硫酸盐处理后的FBXO32启动子序列为标准序列，并将其输入甲基化检测软件PyroMark CpG，通过该软件分析获得样本的FBXO32启动子甲基化状态。