[发明专利]用于犬瘟热病毒检测的引物和探针及其用途

说明书

本发明公开了一种用于犬瘟热病毒检测的侧流层析试纸条RT‑RPA引物和探针组合，其F引物、R引物及探针序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。本发明还公开了利用所述引物和探针组合，不依赖于检测设备对犬瘟热病毒可视化现场快速检测方法。本发明的引物和探针特异性强，仅对犬瘟热病毒检测呈阳性，对其它病毒均呈阴性，灵敏度高，检出限为9.4×10¹拷贝。本发明方法可以有效应用于犬瘟热疫情的现场诊断，操作简单，反应时间短，对于经济欠发达地区装备较差的实验室，对于犬瘟热疫情现场和野外现场诊断中，将具有非常光明的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于犬瘟热病毒检测的引物和探针及其用途。

背景技术

犬瘟热(Canine distemper，CD)是由犬瘟热病毒(canine distemper virus，CDV)引起的一种感染犬科动物的高度传染性疾病，主要表现为呼吸道症状、胃肠炎、皮炎、神经症状等。犬瘟热导致的临床症状非常广泛，和其他疫病导致的临床症状相似，从而难以从临床症状上对犬瘟热进行有效诊断。因此，对犬瘟热的有效快速诊断对于专业人员及时采取有效措施，及时控制疫情和防止疫情扩散具有重要意义。

CDV属于副黏病毒科麻疹病毒属，是一种不分节段的无囊膜负链RNA病毒。目前已经建立了一系列基于CDV RNA检测的犬瘟热诊断方法，如RT-PCR、巢氏RT-PCR、实时荧光RT-PCR、RT-LAMP和RT-iiPCR方法等。上述方法具有不同的检测灵敏性，也在犬瘟热的有效控制中发挥了重要作用。RT-PCR和实时荧光RT-PCR方法主要应用于装备良好的实验室，需要精准昂贵的PCR设备和经过严格培训的技术人员，因此不适用于经济欠发达地区装备较差的实验室，更不适用于野外现场检测。相比较于PCR方法，等温扩增方法不需要昂贵的精准扩增设备，也不需要连续的电力供应和复杂的样品处理，已经在多种传染病包括动物疫病的快速检测，尤其是现场检测中发挥了重要作用。RT-iiPCR依赖于专门的检测设备(POCKITTMAnalyser)，反应时间为60min；RT-LAMP需要6条引物，设计复杂，而犬瘟热病毒变异性强，反应时间一般需要60min。上述等温检测方法反应时间较长，一般需要60min，同时需要专门的检测设备或水浴锅，对检测结果的判定依赖于检测设备或琼脂糖凝胶电泳。因此，上述针对犬瘟热病毒的等温扩增方法在野外现场应用存在一定的限制，难以有效展开。对于没有PCR仪的实验室，以及处于现场诊断的需要，一种反应迅速、操作方便的CDV检测技术对于犬瘟热的有效诊断依然具有重要意义。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是一种操作简便、反应快速、特异性强、灵敏性高，并且成本较低的等温扩增技术。RPA技术一般在15-20min内完成扩增，并且可以通过琼脂糖凝胶电泳、实时荧光信号检测或侧流层析试纸条(LFS)等不同方式实现对RPA结果的检测。对RPA扩增结果的实时检测一般基于反应体系中的exo探针和Exonuclease III，以及能够实时监测扩增荧光信号的设备，而对RPA结果的不依赖于检测设备的直接肉眼观察则需要使用nfo探针、Endonuclease IV和LFS。目前尚未有基于nfo探针、LFS和RPA的犬瘟热病毒检测方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对上述技术现状，提供一种用于犬瘟热病毒检测的引物和探针，并提供其在建立不依赖检测设备的犬瘟热病毒可视化现场快速检测方法中的应用。

为达到上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：

一种用于犬瘟热病毒检测的引物和探针组合，其特征在于：

F引物序列如SEQ ID NO:1所示，R引物序列如SEQ ID NO:2所示，探针序列如SEQID NO:3所示。

进一步地，本发明还提供了上述引物和探针组合在LFS RT-RPA(侧流层析试纸条实时RPA)法检测犬瘟热病毒中的用途。