[发明专利]GMP级无血清悬浮细胞大规模生产慢病毒的方法

说明书

本发明提供了GMP级无血清悬浮细胞大规模生产慢病毒的方法。具体地，本发明方法包括(a)提供包装细胞的种子液；(b)将所述种子液接种于第一培养液中；(c)进行包装细胞的传代培养；(d)当满足换液触发条件时，启动换液操作；(e)重复步骤(c)和(d)n次；(f)当满足转染触发条件时，启动转染操作；(g)任选地进行转染后换液；(h)对经转染的包装细胞进行培养；(i)当满足换液触发条件时，启动收获与换液操作；(j)重复步骤(h)和(i)m次；(k)将各次回收的回收液进行合并；和(l)纯化处理；其中，在各步骤中采用的培养液均为无血清细胞培养液。本发明的方法可以大规模且高效地制备高效价的慢病毒。此外，本发明方法可以满足GMP生产对于生产质量的高要求。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及GMP级无血清悬浮细胞大规模生产慢病毒的方法。

背景技术

基因治疗(gene therapy)是指将外源治疗性基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，或通过外源基因表达的产物作用于疾病靶点，以达到治疗目的。

一类常用的重组慢病载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。与一般的逆转录病毒载体不同，重组慢病载体对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。重组慢病载体因其体内外生物滴度高和免疫原性低等优势，成为CART细胞和基因治疗的首选转基因载体。

成熟的HIV-1病毒直径100～120nm、呈20面体对称结构、球形，电镜下可见一致密圆锥状核心，内有病毒RNA分子和酶，后者包括逆转录酶、整合酶(integrase)和蛋白酶(protease)。HIV-1的最外层为脂蛋白包膜，膜上有表面蛋白(gp120)和相嵌蛋白(gp41)两种糖蛋白，gp120为刺突，gp41为跨膜蛋白。包膜内面为P17构成的基质蛋白(matrix)，包膜内为衣壳蛋白(P24)包裹的RNA。

目前的重组慢病毒载体是通过基因改造的方法，使慢病毒基因组中只留下包装信号和目的基因转录元件，而将逆转录酶、包膜蛋白VSVG、gag/pol、rev、tat等结构或调节基因分散在不同的载体上，同时删除致病基因，从而保证重组慢病毒载体的安全性。

HEK293T是一株来源于人胚胎肾上皮的细胞株，由HEK 293细胞系通过腺病毒E1A基因的转染而获得，能表达SV40的大T抗原、含有SV40复制起始点与启动子区。含有SV40病毒的复制起始位点的真核表达载体可以在HEK293T细胞中实现高效的复制和转录，从而提高外源基因的表达水平。因此HEK293T细胞广泛应用于慢病毒包装，能获得较高滴度的慢病毒料液。

然而，HEK293T细胞作为慢病毒生产细胞株仍然存在以下缺陷：1)大T抗原存在潜在的致癌风险，下游工艺如果不能很好的对其去除，用于临床治疗存在一定风险，且大T抗原存在一定的免疫原性，会增加临床治疗的难度；2)HEK 293T是一株贴壁细胞，用细胞工厂或者转瓶生产较难真正实现工业化；3)贴壁能力较弱，使用微载体技术细胞容易脱落，产毒效能明显降低。

此外，虽然开发了一些基于悬浮细胞来生成慢病毒的技术，但是现有的生产方法仍存在一些不足，例如，不适合大规模生产，难以满足GMP生产的严格要求，生产出的病毒效价较低等。

因此，本领域迫切需要开发能够在无血清和悬浮培养培养下，通过包装细胞大规模高效生产慢病毒的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种在无血清和悬浮培养培养下，通过包装细胞大规模高效生产慢病毒的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种无血清悬浮细胞生产慢病毒的方法，包括步骤：

(a)提供一种用于生产慢病毒的包装细胞的种子液，所述的包装细胞是悬浮生长的包装细胞；